Loading

35. Replikace DNA

Uchování života = uchování genetické informace – vyžaduje, aby při synteze byla zajištěna identita nových molekul → oprava vznikajících chyb( korekturní čtení)
Syntéza probíhá v S fázi (kromě reparační syntézy DNA a syntézy DNA v mitochondriích)
• DNA je universálním nosičem genetické informace
• oba řetězce jsou komplementární
• vznikají dvě přesné stejné kopie původní dvoušroubovice s identickou sekvencí
nukleotidových párů - genetickou informací
• při replikaci DNA zůstává jeden řetězec původní a druhý, komplementární je nově
syntetizován → semikonzervativní replikace

Princip replikace
• průběh replikace je v zásadě stejný jak u prokaryot tak i eukaryot
• začíná v tzv. replikačním počátku - ORI, na ten se váže iniciační protein, který rozvine dvoušroubovici → navázání replikačního aparátu
• replikace DNA je zpravidla dvousměrná, od místa počátku se na obě strany molekuly rozšiřují tzv. replikační vidlice = theta replikace
• na cirkulární DNA je jen jeden replikační počátek, na lineární více
• jednotka replikace = replikon = autoreplikující se segment chromozomu s replikačním počátkem, od kterého se replikace rozšiřuje oběma směry
• neprobíhá ve všech replikonech současně, ale postupně v průběhu celé S fáze
• rychlost je asi 1000 párů bazí za minutu
• replikační bublina – syntéza probíhá oběma směry

DNA polymerázy
• katalyzují vznik fosfodiestrické vazby mezi 5´ koncem volného deoxyribonukleotid trifosfátu a 3´ koncem rostoucího řetězce
• nové vlákno tedy roste ve směru 5´→3´
• existuje více typů DNA polymeráz
• u prokaryot: DNA polymeráza I: syntéza DNA, korektury řetězce, reparace DNA, vyštěpuje krátké sekvence RNA-primery pro replikaci DNA
DNA polymeráza III: syntéza DNA, korekce správnosti párování bazí
u eukaryot: polymerázy α,δ - mají také opravnou funkci, syntéza
• DNA polymeráza gama syntetizuje mtDNA.

Okazakiho fragmenty
• DNA polymerázy připojují nové nukleotidy vždy jen v jednom směru 5´→3´
• na jednom vláknu probíhá syntéza komplementárního řetězce normálně - směr 5´→3´= vedoucí řetězec
• na druhém řetězci probíhá „antiparalelně“, v obráceném směru -synteza je diskontinuitní; probíhá v malých úsecích = okazakiho fragmentech, rovněž ve směru 5´→3´
• okazakiho fragmenty jsou průběžně spojovány do souvislého vlákna DNA ligázou,
vlákno syntetizované z Okazakiho fragmentů = zpožďující se řetězec
• syntéza Okazakiho fragmentů podle opožďujícího se řetězce je katalyzována DNA polymerázou alfa.
• DNA polymeráza III a α spouštějí polymeraci jen když je na DNA navázán primer = spouštěč syntézy (komplementární úseku RNA) - bez něj se replikace nerozběhne
• primer - potřebný k rozběhnutí replikace DNA v každém Okazakiho fragmentu
- syntetizuje enzym primázu
- na konci je odstraněn polymerázou I při korektuře DNA
• nasyntetizované fragmenty DNA spojeny opět ligázou

Rozvinutí molekuly DNA
• molekuly, které způsobují rozvinutí DNA:
• destabilizující proteiny
• DNA topoizomeráza → uvolňuje nadšroubovicové vinutí
• DNA helikáza → rozvolňuje dvojvlákno
• další kategorie proteinů udržuje úsek DNA lineární
• nová DNA se svinuje do šroubovice „svíracím“ proteinem, což je jedna z podjednotek DNA polymerázy III
• proteiny účastnící se replikace vytvářejí komplex - replisom
• energii k polymeraci dodávají nukleozidtrifosfáty a ATP


Ukončení replikace
a) cirkulární chromozom - 3´ konec vedoucího řetězce se naváže na 5´ konec
opožďujícího se řetězce → uzavřená kruhovitá molekula

b) lineární molekula – po odstranění RNA primeru exonukleázou - nemůže být tento konec dosyntetizován → chromosom se postupně zkracuje (opakované replikace)
- tomu brání opakující se sekvence nukleotidů - telomery - jejich zkrácením se v podstatě nezredukuje počet strukturních genů
- telomerické sekvence se prodlužují činností enzymu – telomerázy – obsahuje sekvence RNA komplementární k telomerickým sekvencím

Telomery a telomeráza
1. Problém koncové replikace chromozomů:
- DNA polymerázy nemohou z prostorových důvodů replikovat chromozomy až k jejich úplnému konci, části DNA na 5´konci zůstane nezdvojená. To by vedlo k postupnému zkracování chromozomů.
2. Problém odlišení fyziologického konce chromozomů a zlomů v DNA

• Telomery obsahují opakované krátké nukleotidy bohaté na thymin a guanin. Nenesou genetickou informaci, může docházet k jejich zkracování. Bez telomer je ohrožena možnost opakované replikace celých chromozomů.
• Některé buňky umí kompenzovat ztrátu telomer.
• 1984 objeven enzym telomeráza,který syntetizuje telomery bez předlohy – telomeráza má molekulu RNA, která obsahuje matrici pro syntezu telomerické podjednotky
• Telomeráza se naváže na 5´konec DNA a slouží jako templát (předloha) pro tvorbu DNA a dosyntetizuje repetitivní telomerický motiv. Poté se telomeráza posune o jeden motiv a celý proces se opakuje. Syntéza telomerické DNA pomocí telomerázy probíhá před začátkem samotné replikace.
• Telomeráza je u všech eukaryotních organismů, každý organismus má druhově specifickou RNA matrici.
• Telomeráza je aktivní v průběhu embryonálního vývoje, v dospělosti většina lidských buněk nemá telomerázu aktivní.
• Proto může po narození proběhnout pouze určitý počet mitóz.
• Leonard Hayflick prokázal,že somatické buňky se mohou v lidském těle množit max 60x.

Telomeráza a stárnutí:
• Novorozenecké buňky se mohou dělit 80-90x, ale buňky 70ti letého člověka jen asi 20-30x
• Je prokázáno, že telomery se během stárnutí zkracují.
• Intaktní zůstávají telomery pouze v zárodečn linii.

Telomeráza a malignita:
• Tel. aktivita byla prokázána ve většině nádorových buněk a v buňkách zárodečné linie.
• Mutace mohou odblokovat telom. aktivitu, buňky se mohou neomezeně dělit.
• Látky schopné inhibovat telomerázu by mohly selektivně ničit nádorové buňky.

Syntéza DNA je asymetrická
• předbíhající a opožďující se (leading a lagging) řetězce jsou jen relativní pojmy!!
• syntéza předbíhajícího se řetězce DNA je kontinuální, katalyzována DNA polymerázou delta (katalyzuje také dokončení opožďujícího se řetězce)
• Má exonukleázovou aktivitu.

Korekturní čtení
• DNA polymeráza delta má i 3´- 5´exonukleázovou aktivitu, může korigovat chyby, ke kterým při replikaci zákonitě dochází. Toto tzv. korekturní čtení zajišťuje stabilitu při přenosu genetické informace.
• Proč syntéza DNA probíhat od 5´ke 3´konci?---umožňuje to opravu chyb!!


Replikace in vitro
• vyžaduje multiproteinový komplex + specif. Sekvence pro začátek či konec replikace
• řetězová polymerázová reakce= PCR = nevyžaduje žádný složitý aparát, jen zvláštní DNA polymerázu a syntetické primery (pro zahájení replikace):
• zahájení replikace – sekvence 15-20 nukleotidů – odpovídají sekvenci na konci úseku DNA, který má být namnožen
• další komponenty: taq polymeráza +všechny 4 deoxyribonukleozidtrifosfáty
• jeden cyklus trvá asi 5 minut
• výchozí materiál může být i jen jedna molekula DNA
• uplatnění: molekulová genetika
detekce infekčních agens
prenatální diagnostika atd

Žádné komentáře:

Okomentovat