Princip:
Fragment DNA získaný jakýmkoliv způsobem může být v laboratorních podmínkách zmnožen metodou, která se nazývá klonování DNA. Její podstata spočívá v tom, že daný fragment DNA je připojen na vektor ( plazmid, bakteriofág, virus) a získaný hybridní plazmid je množen v baktérii E. coli.
Přenos plazmidu do bakterií se provádí pomocí osmotického šoku, kterým se dočasně naruší stěna bakterií a umožní se přechod makromolekul do nitra bakterií. Pouze velmi malé procento takto ovlivněných bakterií přijme hybridní plazmid. To však není překážkou, neboť pomocí vhodného selekčního systému můžeme buňky s plazmidem namnožit v libovolném množství, přičemž všechny ostatní bakteriální buňky zahynou. Princip spočívá v tom, že původní kmen baktérií je citlivý na určité antibiotikum a vektor, který slouží k přenosu DNA, přenáší současně i rezistenci vůči tomuto antibiotiku. V přítomnosti antibiotika rostou tedy pouze bakterie, které mají začleněn vektor. Po vypěstování dostatečného množství bakterií je třeba DNA izolovat, oddělit bakteriální DNA od plazmidové ( na základě velkého rozdílu v molekulové hmotnosti je to snadné) a nakonec oddělit z plazmidové DNA ten fragment DNA, který jsme potřebovali namnožit. Výsledkem je, že máme dostatečné množství DNA, abychom mohli provádět další experimenty.
Klonování DNA
Existuje mnoho postupů klonování DNA, všechny však z pravidla zahrnují těchto pět kroků:
1. inzerce cizorodé DNA do klonovacího vektoru
2. vnesení vektoru do hostitelských buněk ( nejčastěji bakterií)
3. amplifikace vektoru v hostitelských buňkách
4. selekce těch buněk, které obsahují namnožený vektor
5. identifikace buněčných klonů obsahujících požadovaný cizorodý gen
1.
Inzerce cizorodé DNA do klonovacího vektoru. Přirozené vektory, tj. plazmidy nebo fágový genom, jsou pro rekombinantní technologie zpravidla dále zpracovány: odstraněny nepotřebné sekvence a jsou vloženy geny, např. pro rezistenci na antibiotika. Vektory obsahují dále rekogniční sekvence pro řadu restrikčních enzymů. Geny pro rezistenci na antibiotika umožňují selekci buněk nesoucích vektor, přítomnost restrikčních míst umožňuje inzerci DNA fragmentů připravených různými restrikčními enzymy. Klasický vektor pro klonování v E. coli je plazmid pBR322. Obsahuje geny pro rezistenci na ampicilin a tetracyklin a sekvence 10 různých restrikčních enzymů. Některá restrikční místa leží i uvnitř genů pro rezistenci. Je li integrována cizorodá DNA právě do tohoto úseku, projeví se to ztrátou rezistence na uvedené antibiotikum, což se využívá pro selekci buněk nesoucích vektor a cizorodou DNA. Před vlastní inzercí je plazmid otevřen některou z restriktáz a stejnou restriktázou je rozštěpena i cizorodá DNA. Fragmenty DNA jsou pak inkubovány s linearizovaným plazmidem v takových podmínkách, aby se komplementovaly lepivé konce a DNA ligázou se pak spojí fragmenty kovalentní vazbou. V této směsi fragmentů se nespojují jen plazmidy s požadovaným úsekem DNA, ale také s fragmenty jinými, fragmenty DNA navzájem, stejně tak i plazmidy navzájem. Ve velkém množství kopií plazmidů i fragmentů se však objeví i kombinace požadované.
2.
Vnesení rekombinovaného vektoru do hostitelských buněk. Vektor se dostává do hostitelské buňky transformací ( přímým vstupem DNA přes buněčnou stěnu a plazmatickou membránu) nebo pokud je vektorem fágový genom, tak cestou infekce buňky fágem.
3.
Amplifikace rekombinantního vektoru v bakteriích. Rekombinované plazmidy se množí v buňkách jako plazmidy normální, tj. nareplikují se desítky až stovky kopií v jedné buňce. V jedné kolonii takových buněk je pak výtěžek plazmidové DNA vysoký.
4.
Selekce kolonií nesoucích rekombinantní vektor. Selekce buněk nesoucích rekombinantní vektor je při klonování zásadním krokem, neboť v populaci transformovaných buněk jsou i buňky, které byly transformovány nerekombinovanými vektory nebo cizorodou DNA, která nemá schopnost se replikovat. Při transformaci plazmidem pBR322 se hledají při selekci kolonie rezistentní na ampicilin a citlivé na tetracyklin. Tato kombinace znaků je zárukou, že vektor má zabudovanou cizorodou DNA, neboť restriktáza Hindlll otevřela gen pro rezistenci na tetracyklin, do kterého se vložil fragment vzniklý působením téže restriktázy.
5.
Identifikace kolonií obsahujících konkrétní cizorodý gen. Ve většině případů jsou buňky transformovány různými fragmenty cizorodé DNA a pouze několik z nich nese gen, který je studován. Kolonii takových buněk můžeme detekovat DNA sondou ( komplementární řetězec obsahující radioaktivní či jinak značené nukleotidy) nebo hledáme proteinové produkty uvedeného genu, např. fluorescenčními protilátkami.
Technika klonování má však také limity, jedním z nich je poměrně malé množství DNA, které může být vloženo do plazmidu. Existují sice speciálně upravené fágové vektory ( kosmidy), které mohou včlenit DNA do rozsahu až 30 000bp, ovšem řada eukaryontních genů má rozsah ještě mnohem větší. Mnohé geny také vyžadují pro svou funkci regulační sekvence nebo i jiné geny. Vektorem, který splňuje tyto požadavky, je umělý kvasinkový chromosom (YAC). Tento vektor nese všechny potřebné součásti chromosomu: centromeru, sekvenci zajišťující počátek replikace i telomery . Do tohoto chromosomu může být rekombinantními technikami vnesena cizorodá DNA v rozsahu 300 000- 1,5 mil. bp.
DNA knihovny
Do bakteriálních buněk je možno vložit fragmenty z celého buněčného genomu, např. genomu lidské buňky a přechovávat je v naklonované formě. Je tak k dispozici materiál, ze kterého mohou být izolovány jednotlivé geny podle volby. Kolekce klonovaných DNA v bakteriálních buňkách se nazývá genomová knihovna. Menší, speciální knihovna se dá připravit naklonováním komplementární DNA. Tato DNA je syntetizována in vitro z mRNA buňky pomocí reverzní transkriptázy a po opracování vhodnou restrikční endonukleázou je včleněna do klonovacího vektoru a v bakteriích naklonována. Kolekce klonů obsahujících cDNA se nazývá cDNA knihovna. Geny této cDNA knihovny obsahují sekvence bez intronů.
Genové inženýrství
Technologie rekombinantní DNA a klonování genů umožňují vložit jakoukoliv DNA sekvenci do bakteriální buňky, naklonovat ji, případně zajistit její expresi. Tyto cílené zásahy do genomu se označují jako genové inženýrství.
Využití:
Možnost použít bakterie pro výrobu savčích proteinů, např. hormonů, růstových faktorů, interferonu, tj. proteinů, které živočišné organismy produkují v nepatrných množstvích.
Gen pro inzulin. Dnes je lidský inzulin připravený bakteriemi již terapeuticky využíván.
Genovým inženýrstvím byly připraveny již desítky medicínsky důležitých produktů, např. růstový hormon, interferon, erytropoetin, interluekiny, virové antigeny pro vakcinaci.
Dalšími aplikacemi genového inženýrství jsou rekombinantní mikroorganismy produkující antibiotika, enzymy a další organické látky, či mikroorganismy odbourávající odpadní látky.
Využití u transgenních organismů.
Žádné komentáře:
Okomentovat