• Průměrně na každých 1000 bp najdeme rozdíl v jednom páru bazí mezi dvěma náhod-ně vybranými lidmi
• Průměrný odhad mutační rychlosti u člověka je cca 1 x 10-6 mutací na lokus a generaci
• Většina změn v nekódujících oblastech
• Odlišnosti v DNA = genetické polymorfismy a vzácné mutace
Polymorfismy
• polymorfismus = alela tak častá, že se nachází na více než 1% chromozómů v populaci
• vzácná varianta = alela se nachází na méně než 1% chromozómů v populaci
Příčiny odlišností v DNA
• Bodové mutace – SNP (single nucleotide polymorphism)
• Další typy mutací
• Přítomnost repeticí (expanzní mutace, mikrosatelity, minisatelity…)
Důsledky rozdílů v DNA
• Polymorfismus v kódující DNA – může (a nemusí) vést k polymorfismu na úrovni protei-nu a fyziologické funkce (např. ABO systém, genetická onemocnění)
• Polymorfismus v nekódující oblasti – užitečný marker (např. minisatelity, mikrosatelity, SNP)
Polymorfismy v kódujících oblastech
• Stanovení krevních skupin
• Stanovení sérových proteinů
• Stanovení isoenzymových variant
• Stanovení antigenních specifit HLA systému
• Genetické choroby
Mnohotná alelie - v populaci existuje více běžných forem daného genu, (u každého ale samozřejmě jen dvě).
SEKVENCE LIDSKÉ DNA A POLYMORFISMY DNA
Lidská DNA se vyznačuje vysokým stupněm variability. Vedle jednotkových (unikátních) sek-vencí jsou v DNA přítomny i tzv. repetitivní sekvence.
Unikátní sekvence jsou geny, které se v haploidním genomu vyskytují pouze v jedné kopii nebo několika málo kopiích (tzv. genové rodiny - např. strukturálně a funkčně podobné alfa a beta globi-nové geny jsou ve 4 a 5 kopiích na chromozomu 16 a 11). Tyto sekvence představují asi 5 % lidské-ho genomu.
Repetitivní sekvence jsou různě dlouhé úseky vyskytující se v genomu ve velkém počtu kopií buď disperzně po celém genomu, nebo jsou tandemově uspořádány.
• středně repetitivní sekvence vyskytující se v 10 000 – 100 000 kopiích. Jsou to např. geny pro rRNA, tRNA, histony (tvoří asi 30% lidské DNA). Délky repetic kolísají od 100 – 300 bp až do 5000 bp.
• vysoce repetitivní sekvence (tvoří asi 10 - 15 % lidské DNA) jsou v genomu ve více než 100 000 kopií, převážně v oblasti centromer a telomer a v heterochromatinu.
Dělí se na:
-tandemově uspořádané repetitivní sekvence – podle délky repetitvních motivů, počtu jejich kopií v genomu a nukleotidového složení repetitivních sekvencí se dále dělí na:
- satelitní DNA – jedná se o motivy dlouhé 20 – 1000 bp tvořících bloky o velikosti až milionu párů bazí (při centrifugaci DNA v gradientu chloridu cesného (CsCl) tvoří malé pruhy = sateli-ty; příčinou odlišné sedimentační rychlosti je, že repetitivní úseky mají větší zastoupení lehčích párů A T, než těžších párů G–C). Je to např. -satelitní rodina DNA repetic (motiv asi 171 bp) v centromerické oblasti každého chromozomu, která je zodpovědná za správnou funkci centromery a správnou segregaci chromozomů při mitóze a meióze. Jiné repetice (5 nukleotidový motiv) se nacházejí v heterochromatinových oblastech v proximálních částech dlouhých ramen chromozomů 1, 9, 16 a po celé délce dlouhého ramene Y chromozomu.
- minisatelitní DNA – představuje motivy dlouhé 10 – 20 bp tvořících bloky o velikosti až 20 000 bp. Jsou součástí telomer i jinde v chromozomech. Podmiňují variabilní délku restrikč-ních fragmentů, které se liší právě počtem tandemově opakovaných repetitivních sekvencí – VNTR (variable number of tandem repeats). Jsou podkladem DNA fingerprintingu.
- mikrostelitní DNA – jsou velmi časté krátké motivy (1 – 5 bp) v blocích o velikosti až 150 bp, které mohou být na nejrůznějších místech v genomu. Tyto repetice podmiňují polymorfismus označovaný jako STR (simple (short) tandem repeats) nebo VNDR (variable number of di-nucleotide repeats), kdy se nejčastěji opakuje motiv (CA)n a tvoří asi 0,5 % genomu.
-rozptýlené repetitivní sekvence – mohou mít lékařský význam, protože způsobují dědičná one-mocnění procesem retrotranspozice. Mohou se v genomu náhodně přemístit a tím mohou porušit sekvenci kódujících oblastí, tj. inzerční aktivaci či represi důležitého genu. Četnost retrotranspozic v lidském genomu není přesně známa, ale odhaduje se, že způsobují asi 1 z 500 mutací. Navíc mohou vyvolávat mutace i poruchami rekombinace mezi rozptýlenými repeticemi. Podle délky re-petice a množství jejich kopií se dělí na:
-LINE (long interspread elements) – dlouhé sekvence (kolem 6 500 bp) přítomné v 20 – 100 ti-sících kopií
-SINE (short interspread elements) – středně dlouhé (asi 300 bp) repetice relativně si vzájemně podobné přítomné ve stovkách tisíc kopií. Příkladem jsou tzv. Alu sekvence, kterých je v ge-nomu asi 750 000 kopií a představují asi 5 % lidského genomu.
Vysoká variabilita repetitivních sekvencí je příčinou mnoha polymorfismů DNA, tedy variant v sekvenci DNA určitého lokusu na různých chromozomech a u různých jedinců s populační frek-vencí přesahující 1 %. Fenotypově se obvykle neprojevují, neboť se nacházejí buď v úsecích mezi geny (extragenové) nebo uvnitř genů (intragenové), zejména v intronech, ale i v nepře-kládaných nebo kódujících oblastech genů. Některé polymorfismy vedou k záměně aminokyseliny a pak se mo-hou projevit proteinovým polymorfismem. Stále častěji se ukazuje, že i polymorfismy v nekódujících oblastech či neměnících aminokyselinový smysl nemusí být fenotypově neutrální – mohou podmiňo-vat určité lehčí, netypické nebo méně penetrantní formy nemocí (hranice mezi polymorfismem a mu-tací je někdy velmi úzká). Polymorfismy jsou důsledkem přirozené variability DNA a jsou důležité v genetickém mapování, diagnostice, individuální identifikaci i při studiu fylogenetické příbuznosti mezi organismy.
Polymorfismy délky restrikčních fragmentů (RFLP)
Nejsnáze detekovatelné polymorfismy jsou polymorfismy délky restrikčních fragmentů (RFLP). Jestliže působíme na určitou DNA některou restrikční endonukleázou (RE), molekula se rozštěpí na různě dlouhé fragmenty podle lokalizace rozpoznávacích sekvencí použitého enzymu. DNA od je-dinců téhož druhu dává stejně dlouhé fragmenty, někdy se však délka fragmentů od různých jedinců liší. Tato variabilita bývá podmíněna různými molekulárními mechanismy (obr. 1):
• variabilitou v počtu a umístění restrikčních míst pro určitou RE, což je dáno variabilitou nukleo-tidů v rozpoznávací sekvenci a restrikčním místě (RFLP = Restriction Fragment Length Polymor-fism); variabilita je nejčastěji způsobena mutací (záměnou C za T v důsledku deaminace 5-methylcyto-sinu) v rozpoznávací sekvenci nebo restrikčním místě a DNA se neštěpí – vznikají fragmenty odlišné délky. Buď je fragment delší (jeho délka je součtem délek dvou sousedních fragmentů), nebo naopak se vytvoří nové restrikční místo, což vede ke zkrácení fragmentů. Přítomnost tohoto bodového polymorfismu bývá často zjišťována RE, které rozpoznávají sekvence obsahující CG. Variabilní nukleotidy se vyskytují průměrně 1x na každých 100 až 500 nukleotidů. Detekují se Southernovou metodou pomocí specifické sondy nebo metodou PCR.
• přítomností kratších opakujících se úseků, přičemž počet tandemově opakujících se sekvencí DNA mezi dvěma restrikčními místy může být různý (obr. 2) na každém z homologních chromo-zomů (VNTR = Variable Number of Tandem Repeat). Rozdíly v počtu tandemových repetic vznikly pravděpodobně mechanismem asymetrického crossing-overu mezi homologními částmi chromozomů. Tento typ polymorfismu se nachází v tzv. hypervariabilních lokusech rozptýlených ve všech eukaryontních genomech. Jsou tvořeny variabilním počtem minisatelitů, které jsou většinou bohaté na CG a představují v genomu místa s vyšší rekombinační aktivitou. Jestliže se k identifikaci VNTR použije metoda PCR nebo hybridizační sonda specifická právě pro mini-satelitní DNA v Southernově metodě, dostane se po elektroforéze a následné autoradiografii veliký počet proužků, jejichž uspořádání je pro každého jedince zcela unikátní, s výjimkou pouze jednovaječných dvojčat. Pravděpodobnost, že u dvou osob bude obraz polymorfismu stejný, je asi 10-20. Proto se tento polymorfismus využívá k identifikaci osob v kriminalistice nebo při paternitních sporech (dědičnost podléhá Mendelovým pravidlům) jako genetické otisky prstů – tzv. DNA fingerprinting (obr. 3).
• přítomností různého počtu opakování mikrosatelitní DNA. Tento polymorfismus se označuje jako STR = Short Tandem Repeats nebo VNDR = Variable Number of Dinucleotide Repeats. Byl objeven pomocí metody PCR v roce 1998. Mikrosatelity jsou úseky DNA tvořené opakováním motivu o délce dvou, tří nebo čtyř nukleotidů, např. TGTG•••••TG, CAACAA•••••CAA nebo AAATAAAT•••••AAAT. Repetitivní motiv je přítomen ve 4 – 40 kopiích a v lidském genomu se vyskytuje asi 100 000 krát. Počet opakování základního motivu v jednom mikrosatelitu se může lišit mezi dvěma homologními chromozomy jednotlivce i mezi jednotlivci v populaci. Mikrosatelit je polymorfním lokusem a různé počty opakování v určitém mikrosatelitu tvoří alely tohoto lokusu. Mikrosatelitové lokusy mají obvykle v populaci mnoho alel. Genotypování mikrosatelitů nevyžaduje na rozdíl od RFLP a VNTR metodu Southern blottingu, ale využívá se PCR s primery komplementárními k unikátním sekvencím lemujícím mikrosatelit. Vznikají tak fragmenty lišící se délkou podle toho, kolik je přítomno repetic. V současnosti přibývá chorob, jejichž patologický fenotyp je podmíněn nadměrnou expanzí mikrosatelitní DNA, takže polymorfismus již přerůstá v mutaci. Vzhledem ke své proměnlivosti jsou tyto mutace označovány jako dynamické (viz ta-bulka 1).
Tab. 1: Choroby s nestabilním opakováním trinukleotidů
Polymorfismy jsou detekovatelné Southernovou metodou nebo PCR s použitím restrikčních endonukleáz (viz tabulka 2). Variabilita délky definovaných restrikčních fragmentů je dědičná. Pro-tože každý jedinec nese 2 alely autosomálních polymorfismů, může být buď homozygotem pro jednu nebo druhou alelu polymorfismu, nebo nese obě alely jako heterozygot. I když se dá sondou odhalit velké množství různých délek příslušného restrikčního fragmentu, každý jedinec má maximál-ně 2 různé fragmenty.
Tab. 2: Polymorfní DNA markery v lidském genomu
Žádné komentáře:
Okomentovat