Za fyziologických podmínek jsou komplementární řetězce DNA navzájem drženy slabými nekovalentními vazbami (vodíkové můstky). Oddělování, resp. spojování vláken nastává např. při replikaci DNA nebo transkripci a dá se navodit i in vitro denaturací.
Hybridizace DNA vychází ze schopnosti DNA denaturovat při vysoké teplotě (100°C) nebo v silně alkalickém prostředí (pH13) - separují se obě vlákna DNA. Za příznivých podmínek (stačí teplota 65°C) řetězce mohou opět reasociovat – tzv. renaturace DNA = hybridizace. Prokázáno roku 1961. Jsou-li řetězce komplementární, mohou se spojit, i když jsou z různých zdrojů (DNA-RNA).
Těmito technikami je možno zjistit příbuznost DNA molekul, detekovat přítomnost hledaných úseků DNA (ve směsi mnoha různých molekul vyskytujících se v jedné buňce) pomocí komplementárních nukleotidových sekvencí (značenými sondami), identifikovat nebo izolovat geny.
Jako hybridizační sonda se používá DNA z genových knihoven se známou velikostí molekuly a lokalizací proužku při elektroforéze, cDNA, mRNA event. syntetické oligonukleotidy. V poslední době se užívají i alelově specifické sondy (oligonukleotidy dlouhé asi 20 bp), které za vhodných podmínek hybridizují pouze při plné shodě všech komplementárních nukleotidů. Protože stačí jediná odchylka v některém nukleotidu restrikčního fragmentu, aby k hybridizaci nedošlo, slouží tyto sondy k detekci bodových mutací v rozsahu samotné sondy. Nemohou však odhalit všechny mutace ve vyšetřovaném genu, proto se pro diagnostiku některých dědičných chorob nehodí.
Hybridizace se může provádět buď v roztoku nebo přímo v gelu (gel je však křehký a výsle-dek se nedá archivovat), ovšem nejčastěji na membráně, na kterou je vázán jeden řetězec (např. analyzovaná DNA). Hybridizační membránou jsou buď nitrocelulózové nebo nylonové filtry, které pevně váží jak DNA, tak RNA.
Southern blotting: Přenos rozdělených fragmentů DNA na hybridizační membránu
(Northern – RNA, Western – bílkoviny)
Nejčastější způsob přenosu NK je kapilární atrakce, kdy se pufr nasává buničinou přes agarózový gel a hybridizační membránu. NK se uvolní z gelu a zachytává se v membráně. Účinný přenos NK se uskuteční již za 1 – 2 hodiny. Po přesátí se musí NK na membráně fixovat (pro nitrocelulózové filtry při teplotě 80 °C ve vakuu), pak probíhá (většinou několik hodin) samotná hybridizace se značenou sondou. Po jejím ukončení se filtr opakovaně promyje, tím se odstraní sonda z míst, která nejsou plně komplementární i přebytek nenavázané sondy.
Hybridizační sondy bývají většinou značeny radioaktivním 32P (poločas rozpadu 14,2 dnů), někdy 35S (poločas rozpadu 87 dní); jejich lokalizace se identifikuje autoradiografií.
Stále častěji se používá neradioaktivní značení sond. Takové sondy jsou netoxické, dlouhodobě stabilní s vysokou citlivostí detekce cílové sekvence. Mohou obsahovat nukleotidy s navázaným antigenním haptenem (často používaným je digoxigenin nebo biotin vážící se na uracil). Po hybridizaci se hapten prokazuje specifickou protilátkou (u digoxigeninu) konjugovanou s enzymem – alkalickou fosfatázou nebo křenovou peroxidázou, nebo pomocí avidinu či streptavidinu (u biotinu). Enzymem označený imunokomplex se potom vizualizuje reakcí s vhodným substrátem za vzniku barevného produktu (kolorimetrická detekce), nebo reakce je založena na chemiluminiscenci.
Někdy se hybridizace neprovádí po předchozí elektroforéze, ale izolovaná NK se přímo nanese na hybridizační membránu v podobě skvrn (kulaté - tzv. dot bloty nebo čárky - slot bloty). Pro tuto metodu postačí menší množství analyzované DNA než pro Southern blotting.
Je možné tak detekovat nejen infekční agens přítomné v jaderném lidském genomu (např. přítomnost virové DNA), ale také se užívá k prenatální diag-nostice pohlaví či detekci Y chromozomových přestaveb (např. translokace na jiný chromozom). Jako sonda se zde používá některá spe-cifická sekvence Y chromozomu, např. sekvence Hae 3,4 rozptýlená po celé délce Y chromozomu. Pokud po hybridizaci nevznikne hybridizační signál, znamená to, že v analyzované DNA příslušný úsek chybí. Pokud se jako sonda použije specificky lidská repetitivní Alu sekvence (sek-vence dlouhé asi 30 bp v 500000 kopií rozptýlených po celém genomu), lze tak odlišit lidskou DNA od DNA jiného původu.
Reverzní bloty: Když v analyzovaném vzorku DNA hledáme virovou DNA, přitom daný virus se může vyskytovat ve více virových typech, pak pro jejich rozlišení použijeme reverzní bloty. V takovém případě se na membránu přenesou restrikční fragmenty DNA všech možných virových typů a jako hybridizační sonda se užije označený neznámý vzorek. Ten hybridizuje jen se stejnou (komplementární) virovou DNA.
Stejné metody se mohou použít i k odhalení delecí či jiných genových mutací, ke kterým existují vhodné sondy. Např. u Duchen-novy svalové dystrofie v příslušném genu na X chromozomu bývají delece různě dlouhých úseků DNA. Fragmenty identifikované po elektroforéze pomocí specifických sond jsou kratší než jaké jsou obvyklé u zdravých jedinců.
V jiných případech mutace vyvolá chybění nebo vytvoření nového restrikčního místa. Vznikají pak restrikční fragmenty jiné délky než jaké jsou v nemutované DNA. Např. v genu pro beta globinový řetězec rozpoznává sekvenci CCTGAGG re-strikční enzym SauI nebo MstII. Mutace vyvo-lávající srpkovitou anémii však změní tuto sekvenci na CCTGTGG, která není štěpena. Normální beta globinový gen má 2 fragmenty dlouhé 1150 bp a 200 bp, u srpkovité anémie mutovaný gen má jen 1 fragment délky 1350 bp, heterozygoti mají oba typy fragmentů.
Alelově specifická hybridizace: Jestliže se změny v sekvenci úseku DNA neprojeví změnami délky nebo počtu restrikčních fragmentů, potom lze přímo detekovat defekt metodou alelově specifické hybridizace (ASO). V takovém případě musí být známa alespoň částečná sekvence normální a mutované alely. K hybridizaci se využívají jako sonda syntetické oligonukleotidy v délce asi 20 bp (asi 10 nukleotidů před a 10 nukleotidů za místem předpokládané bodové mutace). Na membránu je nanesena neštěpená denaturovaná DNA, kterou analyzujeme, a podmínky hybridizace jsou takové, aby se každý oligonukleotid navázal jen na dokonale komplementární úsek, tedy buď na normální nebo jen na mutovaný gen. Této metody se užívá např. pro přímou diagnostiku beta talasemie nebo také srpkovité anémie.
Žádné komentáře:
Okomentovat