- neinvazivní molekulárně cytogenetická diagnostická metoda, velmi citlivá
- provádí se na čerstvých tkáních i na tkáních zalitých do parafinu
- umožňuje hodnotit karyotyp a detekovat numerické a strukturní chromosomové odchylky
buňkách v mitose i v nedělících se interfázních jádrech na základě využití fluorescenčních
barviv
- doplňuje a upřesňuje výsledky získané konvenční cytogenetickou analýzou
- získáme různobarevný fluorescenční signál navázaných sond na chromozomu
- v molekulární biologii znamená pojem hybridizace proces spojení dvou komplementárních
řetězců DNA podle pravidel o párování bází (tímto způsobem lze napojit specifickou sondu
se zkoumaným vláknem DNA)
- místo lokalizace značené sondy lze zjistit mikroskopicky v preparátu chromozomů, proto
hybridizace in situ (prostorově lze od sebe odlišit dvě sondy vzdálené jen 1000 párů bazí)
Princip:
Schopnost jednořetězcové DNA sondy značené fluorochromem vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém preparátu s následnou vizualizací a analýzou fluorescenčních signálů ve fluorescenčním mikroskopu.
- fluorescenčním barvivem (např.zelený fluorescein, texaská červeň,...) se označí sonda = malý
fragment DNA (barviva Texas red, FITC atd.)
- DNA sonda se naváže k chromosomální DNA (na základě komplementárního párování)
- za zvýšené teploty (kolem 75°C) dochází k denaturaci vlákna sondy i vyšetřované DNA
- DNA se rozvolní a po následném ochlazení se sonda hybridizuje na vyšetřovaný úsek
chromozomu.
- vlastní hybridizace probíhá při 37°C
Možnosti aplikace FISH: Různé biologické materiály - histologické řezy, tkáňové preparáty (různě zpracované kultivované i nekultivované buňky), izolovaná buněčná jádra
Chromosomové preparáty
Sonda - jako sondu označujeme v molekulární genetice značený úsek nukleové kyseliny (radioaktivně či chemiluminiscencí), kterou použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA na základě komplementarity bází
Značení sond: radioaktivní, neradioaktivní
- přímo - fluorochromy
- nepřímo - např. biotin či digoxigenin, antigenní látka
Centromerické sondy (alfa-satelitní sondy): sondy pro specifické chromosomové struktury
Hybridizují k alfa-satelitní DNA lokalizované v oblasti centromer lidských chromosomů.
Nebo telomerické sondy, hybridizující se sekvencemi telomer.
Vhodné k detekci početních odchylek chromosomů (monosomie, trisomie, tetrasomie, hyperdiploidie, hypodiploidie atd.)
Lokus-specifické sondy: sondy pro jedinečné genové sekvence
Váží se specificky na vybrané místo (lokus) na chromosomu - stanovení některých strukturálních změn.
Slouží k přímé lokalizaci genů a k detekci strukturních chromosomových aberací (delece, translokace, inverze, inzerce, amplifikace atd., nebo mikrodeleční syndromy, specifické translokace u některých malignit atp.)
Tzv. subtelomerické sondy - hybridizují specificky k subtelomerickým oblastem jednotlivých chromosomů, detekce malých terminálních delecí a translokací
Celochromosomové sondy (malovací): sondy pro mnohočetné chromosomové sekvence
Připraveny jako směs fragmentů DNA konkrétního chromosomu. Po jejich aplikaci dojde k “obarvení” celého chromosomu.
Používají se pro určení některých strukturálních aberací, jako jsou translokace, inserce nebo komplexní přestavby (hlavně v buňkách nádorů), a dále pro stanovení původu nadpočetných chromosomů. Tyto sondy vyžadují pouze chromosomy v metafázi, pro interfázní jádra je nelze použít.
Využití:
-určování početních a strukturálních chromozomových aberací (částečných trizomií a
monozomií)
- určení původu vrozených a získaných marker-chromozomů
- srovnání genomů jednotlivých rostlinných a živočišných druhů
- určení chromozomového vybavení jader v interfázi
- studium polohy jednotlivých chromozomů v jádře nebo jednotlivých genů v jádře v interfázi či
v mitóze
- mapování chromozomů
- detekci virových a bakteriálních genů v tkáňových řezech
-detekci a diagnostice maligních procesů (včetně detekce minimální residuální choroby nebo
časného relapsu u leukémií)
Dalším uplatněním metody FISH je detekce submikroskopických chromozomálních aberací, tj. velmi malých změn (zejména delecí nebo duplikací), které nelze běžnou cytogenetickou analýzou prokázat. Příkladem může být diagnostika syndromu DiGeorge, jehož projevy jsou v naprosté většině případů způsobeny mikrodelecí chromozomu 22. K nejzávažnějším symptomům patří zejména vrozená srdeční vada, defekt imunity a v mnoha případech také neonatální hypokalcémie, hypoparathyreoidismus, anomálie patra a psychické poruchy. Mikrodeleci chromozomu 22 lze v současnosti spolehlivě prokázat metodou FISH použitím dvou sond značených různými barvivy. Zelenými signály kontrolní sondy jsou značeny oba chromozomy 22. Nepřítomnost červeného signálu na jednom chromozomu znamená, že chromozom je v této oblasti deletován.
K detekci aberací používáme metodu fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s přímo značenými centromerickými, lokus-specifickými a malovacími sondami. Výsledky molekulárně cytogenetických analýz slouží k doplnění a verifikaci výsledků běžných cytogenetických vyšetření. Na jejich základě lze často přesně stanovit diagnózu i prognózu vyšetřovaných pacientů. V některých případech mají význam i pro další výzkum a objasnění podstaty jednotlivých syndromů. Velký význam má v současnosti také preimplantační vyšetření blastomer po fertilizaci in vitro. Podobně je možné vyšetřit také spermie a pólová tělíska oocytů před zamýšlenou fertilizací.
Výhody této metody
1) komerční dostupnost specializovaných fluorescenčních mikroskopů a software
2) pestrá nabídka fluorescenčně značených sekvencí (prob)
3) možnost použití různých barev pro identifikaci různých sekvencí (multicolor FISH)
4) kombinovatelnost s jinými diagnostickými metodami
5) vysoká citlivost
6) hodnocení i velmi nekvalitních mitóz
7) pozorování i nedělících se nebo terminálně diferencovaných buněk
8) přesná identifikace chromozómů či jejich specifických úseků (genů)
9) krátká doba na získání a interpretaci výsledků
Příklady detegovatelných syndromů v klin. cytogenetice
1)Sy způsobené změnou počtu autosomů: trisomie 21 - Downův sy; trisomie18 – Edwardův sy; trisomie 13 – Patau sy
2)Sy způsobené strukturní aberací autosomů: deleční - del(5)(p15.2) - syndrom Cri-du Chat; mikrodeleční – del(15)(q11-q33) - syndrom Prader-Willi; sy Di Georgeův, Millerův-Diekerův, Williamsův
3)Sy způsobené strukturní aberací či změnou počtu heterochromozomů: početní a strukturní odchylky X ch. – Klinefelterův sy (47,XXY), Turnerův sy (45,X), početní odchylky Y chromosomu – syndrom YY (47,XYY)
FISH v prenatální diagnostice
- detekce chromosomových odchylek v buňkách plodové vody
- vyšetření buněk choriových klků
- sexace embryí
- preimplantační vyšetření blastomer po fertilizaci in vitro
- spermie a pólová tělíska před zamýšlenou fertilizací
FISH v onkocytogenetice: Diagnostika leukémií a preleukémií:
- detekce početních a strukturních odchylek
- určení původu marker chromosomů
- monitorování účinků terapie
- detekce reziduálních leukemických buněk po terapii
- určení původu buněk po transplantaci kostní dřeně
Komparativní genomová hybridizace CGH
- novější variantou metody FISH
- molekulárně - cytogenetická metoda založená na kvantitativní dvoubarevné FISH
- detekuje a mapuje kvantitativní změny genomu (delece, monozomie, trizomie), ne strukturální
přestavby chromozomů = detekuje relativní počet kopií jednotlivých sekvencí mezi dvěma
různými genomy
- metoda je nejvíce používána při analýze chromozomálních aberací v nádorových buňkách
solidních nádorů, neumí však odhalit přestavby chromozomů, které nejsou spojeny se změnami
v množství DNA
- principem metody je současná hybridizace dvou DNA značených spektrálně odlišnými
fluorochromy – nádorové DNA (DNA pacienta) a kontrolní DNA (DNA zdravého jedince)
- analýza - poměr intenzit signálů obou fluorochromů
- delece (1) duplikace
- celková DNA jednoho vzorku se označí červenou fluorescenční barvou, DNA druhého vzorku zelenou barvou. Oba vzorky se smísí ve stejných množstvích a použijí se jako malovací sonda v metodě FISH s normálními metafázickými chromozomy. Potom se změří poměr červené a zelené fluorescence emitované sondou navázanou podél celého chromozomu. Je-li DNA konkrétní oblasti chromozomu zastoupena rovnoměrně u obou vzorků, je poměr signálu 1:1. Jestliže vzorek označený červeně obsahuje abnormální množství genetického materiálu (monozomie, trizomie), posouvá se poměr červené a zelené fluorescence buď k hodnotám nižším než jedna u monozomie, nebo k hodnotám vyšším než jedna u trizomie, a to v těch oblastech chromozomu, kde je abnormální dávka genů.
Mnohobarevná-FISH (Multicolor, mFISH)
- je další aplikací metody FISH
- použití nejméně tří různých fluorochromů zároveň ke specifickému značení DNA sond
- podobná metoda SKY (spektrální karyotypování)
- nezbytným požadavkem metody je soubor 24 různých chromozomových malovacích sond pro
22 lidských autozomů a pohlavní chromozomy X a Y
- každá sonda je označena odlišnou kombinací fluorescenčních barev, v současnosti se většinou
vystačí s kombinací 5 různých fluorochromů (FITC, Spectrum Orange, Texas Red, Cy5,
Diethylaminokumarin - DEAC), základní barvení chromozomů na preparátu se provádí pomocí
DAPI
- hodnocení mitóz se provádí pomocí vysoce citlivé CCD kamery dvěma různými způsoby: u
SKY metody je nakonec vypočítáno spektrum emisního světla a následně všem pixelům
obrazu s identickým spektrem je přiřazena specifická barva, u metody mFISH se obraz
postupně snímá přes 6 různých optických filtrů s úzkým spektrem
- pomocí počítačového programu je mnohobarevný obraz analyzován po jednotlivých pixelech a
pro každý bod je nalezen nejlépe barevně odpovídající chromozom
- využití zejména v nádorové cytogenetice
- využíváno pro karyotypovou analýzu
- umožňuje sledování početních i strukturních změn chromozomů u pacientů s vrozenými nebo
získanými chromozomálními aberacemi
- využívá se k identifikaci translokací a inzercí, neznámých marker chromozomů, derivovaných
chromozomů a komplexních změn karyotypu
Molekulárně-cytogenetické metody
- fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
- mnohobarevná FISH (mFISH)
- spektrální karyotypování (SKY)
- mnohobarevné pruhování s vysokou rozlišovací schopností (mBAND)
- komparativní genomová hybridizace (CGH)
- mikroFISH
Žádné komentáře:
Okomentovat