Předchůdci mikročipů:
- přichycení vyšetřované nukleové kyseliny na pevný podklad
- hybridizace s konkrétní sondou na základě komplementarity příslušných úseků
- detekce sondy
- vyšetření přítomnosti 1 konkrétní sekvence v každém vyšetřovaném vzorku nukleové
kyseliny Þ časově náročný postup
Technika microarrays:
- postavena na principech hybridizace nukleových kyselin
- funguje na opačném principu než dosavadní metody tj. na velmi malých ploškách čipů je
umístěno velké množství DNA sond (stovky/cm2)
- DNA sondy připraveny zpětným přepisem mRNA na jednořetězcovou copyDNA (pomocí
reversní transkriptázy = retrovirový enzym)
- cDNA = DNA komplementární k transkribovanému genu
- nejvíce používaná je technika tzv. microspotting - DNA sondy jsou roboticky nanášeny
pomocí skleněných mikrokapilár o průměru 0,1µm na podložní skla nebo filtry (pevné
povrchy - rozdíl od klasických hybridizačních metod) ve formě nepatrných teček, každá o
velikosti kolem 100µm
- pevné povrchy neporézních materiálů umožňují vytvářet tzv. biočipy (genové sondy na
přesně určeném místě na pevném povrchu)
- ukotvení hybridizačních sond na skleněných destičkách se provádí silanizací skleněného
povrchu látkami, které nabízejí k ukotvení své aminoskupiny
- aplikuje se jen malé množství biologického materiálu
- souřadnice každé mikrotečky s cDNA sondou je přesně známa
- RNA z testované tkáně se nechá se vzorky hybridizovat a vazba se prokazuje fluorescenčně
nebo radiograficky
Základní postup:
- studovaný vzorek nukleové kyseliny je označen fluorescenční značkou (tag)
- v místě nosiče, kde došlo k hybridizaci, je lokalizována fluorescence
- detekce pomocí konfokálních skenovacích zařízení nebo CCD kamer
- fluorescenční emise z microarrays je převedena do digitální podoby a data jsou dále
zpracována
Vyhodnocení:
- získané obrazy se hodnotí pomocí speciálního analytického softwaru, který vyhledá
pozitivně reagující sondy
- hybridizace k určitému klonu odpovídá přítomnosti odpovídajícího genu ve formě mRNA
Využití:
- identifikace nových genů, unikátní informace o změnách v expresi celého genomu
v odpovědi na pokusný zásah, nové diagnostické markery
- ve výzkumu při sledování exprese genů - umožňují jednoduše sledovat rozdíly v intenzitě
exprese (v množství různých mRNA) při různých funkčních stavech buněk
- sledování vlivu prostředí na expresi genů (které, kolik), vedlejší účinky různých látek
(léků),...
- v lékařské diagnostice - hledá se DNA původce, na čipu navázáno mnoho různých DNA
specifická pro mnoho různých původců způsobujících stejné symptomy, místo navázání
DNA prozradí, kdo je vinen
- lékaři mohou použít větší počet DNA mikročipů a sestavit genetický profil pacienta s cílem
určit predispozice k různým onemocněním
- genetické testy mohou určit pravděpodobnost vzniku určitého onemocnění ještě dříve, než
se objeví první příznaky, nejsou však obvykle schopny určit okamžik vzniku onemocnění
nebo jeho závažnost
- diagnostika onemocnění geneticky ovlivněného - Alzheimrova choroba, diabetes melitus,
některé druhy rakoviny
- v onkologii: Je-li gen v buňce aktivní, pak produkuje kopie ribonukleové kyseliny (RNA) -
transkripty. K měření aktivity genů se nejdříve transkripty v nádorových buňkách „obarví“
přivěšením flurescenční látky. Poté se obsah nádorových buněk rozprostře po mikročipu.
V místech, kde jsou na mikročipu DNA s genem korespondující struktury transkriptu, dojde
k vazbě obou řetězců, a tím se na tečku naváže, spolu s označeným transkriptem také jeho
fluorescenční barvička a příslušná tečka na skleněném čipu začne v ultrafialovém světle
zářit.
- ,,léčba na míru“ - pacientky s rakovinou prsu musí podstoupit náročnou
chemoterapii (70-80% ji nepotřebuje)
- detekcí genů nádorových buněk odhalíme sklony k malignitě / benignitě
=hlubší diagnostika na základě genů nádoru
- proteinové čipy - hudba budoucnosti v diagnostice, předpokládá se, že při většině nemocí
se produkuje specifický protein do krve
- nevýhody – finance, zatím neznalost všech peptidů specifických pro nemoci
Žádné komentáře:
Okomentovat