Vektor – plazmid (malá kruhová molekula dvoušroubovicové DNA schopná autonomní
replikace uvnitř bakterií),
bakteriofág nebo cosmid (vektor vzniklý spojením DNA plazmidu s cos sekvencí
některých virů), který je určen k přenosu cizí DNA a zajistí její expresi (a tím i
produkci cizorodých látek)
- viry jsou i přirozenými vektory při přenosu genů z jednoho druhu organismů na druhý
(onkoviry jsou vektory onkogenů zodpovědných za nádorovou transformaci buňky)
- i když plazmidy tvoří jen zlomek celkové bakteriální DNA, jsou pro ně důležité – často
nesou vitální geny , např. geny pro rezistenci na antibiotika
Vektory musí obsahovat:
- promotor – nutný pro zahájení transkripce, aktivuje DNA - závislou RNA polymerázu
- specifické sekvence – vazebná místa pro navázání RNA polymerázy (mRNA na ribosom)
- iniciační kodon ATG
- terminátor
- gen pro selekční systém, resp. marker
- gen jehož přenesení je našim cílem
Klonování genů - namnožení určitého úseku DNA pomocí klonovacího vektoru, který obsahuje
vložený úsek cizorodé DNA → vložen do organismu (např. do E. coli, kvasinky), tam
namnožení vektoru
- klasický vektor pro klonování v E. coli je plazmid pBR322 (obsahuje geny pro
rezistenci na ampicilin a tetracyklin) – jeho součástí je promotor pro beta-laktamát
Klon – populace DNA molekul vzniklých replikací jediné molekuly
5 kroků klonování:
1) inzerce cizorodé DNA do vektoru
- plazmidy nebo fágový genom jsou pro rekombinaci upravovány: odstranění nepotřebných
sekvencí a vložení genů (např. pro rezistenci na antibiotika)
- vektory obsahují dále rekogniční sekvence pro řadu restrikčních enzymů
- přítomnost restrikčních míst umožňují inzerci DNA fragmentů (rozštěpení plazmidu i cizorodé
DNA restriktázou → lepivé konce se pomocí DNA ligázy spojí kovalentní vazbou)
2) vnesení vektoru do hostitelských buněk
- transformací - přímý vstup DNA přes plazmatickou membránu a buněčné jádro
- pokud je vektorem fág → cestou infekce buňky
3) amplifikace vektoru v hostitelských buňkách
- rekombinované plazmidy se množí
4) selekce těch, které obsahují namnožený vektor
- selekce je zásadní krok, geny pro rezistenci na antibiotika umožňují selekci buněk nesoucích
vektor se zabudovanou cizorodou DNA
- během inzerce DNA do plazmidu se může do plazmidu dostat i sekvence bez požadovaných
vlastností, nebo může dojít ke spojení plazmidů → nejsou rezistentní vůči antibiotikům
5) identifikace buněčných klonů, obsahujících požadovaný cizorodý gen
- detekce DNA sondou (komplementární řetězec nesoucí radioaktivní či jinak značené nukleotidy) nebo hledáním produktů genu (proteinů), např. fluorescenčními protilátkami
Limity techniky:
1) pouze malé množství DNA může být vloženo do vektoru (speciálně upravené fágové vektory
kosmidy - mají větší rozsah)
2) mnoho genů pro svou funkci potřebuje regulační sekvence nebo jiné geny
- YAC = umělý kvasinkový chromosom – vektor splňující požadavky: nese všechny potřebné
součásti chromosomu - centromeru, telomery, sekvenci zajišťující počátek replikace; a může do něj být vnesena cizorodá DNA v rozsahu 300 000 – 1,5 milionu pb
Žádné komentáře:
Okomentovat