- pouze malá část buněk exponovaných cizorodou DNA tuto cizí DNA exponuje do svých chromozomů a funkčně ji integruje –) nutnost nalézt selekční metody, které umožňují najít buňky s integrovanou cizí DNA na pozadí milionů jiných buněk, které cizí DNA nepřijaly
- pracuje na systému vpravení DNA cizí současně s DNA, která kóduje určitý fenotypový projev
- první selekční systém založen na genu pro thymidin kinázu; přežívaly pouze buňky s fčním genem pro thymidin kinázu (TK+), z b. TK- přežily jen ty, kterým byl daný gen dodán, takže k přenosu DNA byly TK-; takových b. linií bylo málo--)hledání nových selekčních sytémů (pro normální bb. , u nichž se vyvolá selektovatelná změna fenotypu)
gpt-gen : kóduje xantin-guanin fosforibosyltransferázu
neo-gen: kóduje fosfotransferázu
Gpt selekce
- Gpt gen umožňuje využívat bakteriím jako zdroje purinových nukleotidů xantin. Odpovídající savčí enzym využívá jako substrát hypoxantin a xantin nemůže využít. Je-li kyselinou mykofenolovou blokována alternativní cesta syntézy purinových bazí, normální savčí hynou, když je v mediu přítomen xantin. Pouze ty buňky, které inkorporovaly bakteriální gen, přežívají.
Neo selekce
- tento selekční systém je založen na bakteriálním genu pro rezistenci na neomycin. Zmíněný gen kóduje enzym, který fosforyluje, a tím inaktivuje neomycin. Eukaryontní buňky jsou citlivé k působení derivátu neomycinu zvanému G418. Také tento derivát je inaktivován produktem neo-genu. Vektor s neo-genem může být využit k přeměně savčích buněk na buňky rezistentní vůči G418. V přítomnosti G418 rostou pouze buňky, které inkorporovaly bakteriální gen.
Oba zmíněné selekční systémy pracují každý na zcela jiném principu, a tak mohou být používány i současně, př: při přenosu dvou různých genů na dvou různých vektorech. Existence těchto selektivních systémů teoreticky umožňuje přenést jakýkoliv gen do savčí buňky.
Žádné komentáře:
Okomentovat