promotor – nejdůležitější – nutný pro zahájení transkripce – aktivuje DNA závislou RNA polymerázu (cizorodá DNA je umístěna až za promotor), (z nejčastěji užívaných silných obligatorních promotorů je promotor beta-laktamát, který je součástí plazmidu pBR 322)
- součástí vektoru také musí být specifická sekvence, která umožní navázání mRNA na ribozóm, a v určité vzdálenosti také iniciační kodon ATG
- jako vektorů se nejčastěji užívají plazmidy – malé kruhové molekuly dvoušroubovicové DNA (přirozeně se vyskytují u některých bakterií – nezávislé jednotky, nesou pouze zlomek celkové bakteriální DNA, ale mnohdy nesou vitální geny – rezistence na antibiotika,…)
plazmidů je možno využívat jen k přenesení DNA do určité velikosti, pro delší sekvence je možno využít: Lambda-fág (až 15kbp), cosmidy plazmidu pBR 322 (30 – 40kbp), virové vektory (virus SV40 – 5200bp) – pro replikaci viru nutná pouze sekvence zahajující replikaci
- přenos DNA do baktérie nečiní žádný problém X přenos DNA do buněk savců je daleko obtížnější: využití virů, chemických látek, fyzikálních faktorů, fúzí biomembrán a přímé mikroinjekce do buněk
viry – retroviry (začlení se pouze do dělících se buněk) a adenoviry (i do nedělících se), trvá jen pár minut, využití hlavně v genové terapii
chemické látky – precipitace DNA pomocí fosforečnanu vápenatého - DNA fagocytována buňkou, část se začlení do chromozomální DNA, malá frekvence vzniku stabilních transfektantů (u lidských buněk asi 10-6), některé látky zvyšují účinnost přenosu DNA do buňky (DMSO - dimethylsulfoxid, butyrát sodný)
fyzikálně podmíněný přenos – elektroporace (aplikace elektrického proudu na buňku) – krátkodobý puls o napětí několika voltů - přechodné narušení plazmatické membrány a umožnění prostupu molekul DNA; Gene Gun – mechanický přenos DNA vázané na kovové mikroprojektily do buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (použití u rostlinných buněk a u buněk kůže)
přenos pomocí fúzí biomembrán – fúze celých buněk (pomocí fúzogenů - polyetylenglykolu, Sendai viru a aplikace elektrického proudu); fúze váčků z biomembrán (váčky z membrány erytrocytů nebo uměle připravené lipozómy – naplněny DNA, potom se indukuje jejich fúze s buňkou, opět pomocí fúzogenů)
mikroinjekce – skleněné mikrokapiláry o průměru 0,1μm, úspěšnost více než 50%, mohou být injikovány libovolné buňky libovolnou DNA, nevýhodou velká pracnost, za hodinu max 100 injikovaných buněk, nenahraditelné při přenosu genů do oplodněných savčích vajíček
transgenní organismy – přímé mikroinjekce do jádra oplodněných vajíček, retroviry, transfekce embryonálních zárodečných buněk, mikroinjekce do blastocysty (- produkce nových proteinů v mléce, živočišné modely lidských nemocí)
selekční systémy – pouze malá část buněk, které jsou vystaveny cizorodé DNA tuto DNA inkorporuje do svých chromozómů a funkčně ji integruje, takové buňky je třeba najít a odlišit od milionů buněk, které cizí DNA nepřijaly - současně s cílovou DNA se do buňky přenese i DNA kódující určitý fenotypický projev, na jehož základě je možno cílovou buňku odlišit (gen pro enzym umožňující rezistenci na neomycin, gen pro thymidin kinázu, gpt-gen umožňující využívat jako zdroje purinových nukleotidů xantin,…)
Žádné komentáře:
Okomentovat