DNA - polymerní molekula nukleotidů vázaných 3´,5´-fosfodiesterovou vazbou, která tvoří dvoušroubovici
- 3´ konec – OH skupina na C3, 5´ konec – fosfátová skupina na C5 uhlíku
- vlivem fosfátových skupin nese molekula DNA záporný náboj
- specifičnost primární struktury DNA má malý vliv na fyzikálně chemické vlastnosti (x bílkoviny – primární struktura přímo určuje struktury další)
- 3 konformační typy (liší se bp na jednu otáčku, délkou, tloušťkou molekuly…)
• pravotočivé – konformace B (Watson, Crick; v buňkách), konformace A (při dehydrataci přechod B->A; spóry bacilů)
• levotočivé – konformace Z (vysoká koncentrace C a G, zejména, je-li cytosin methylován; asi důležitá pro rekombinační děje)
Izolace DNA
- k získání kvalitní čisté NK bez příměsí (bílkoviny, tuky, soli, jiné NK) se používají různé metodiky – buď fenolové, nebo bezfenolové)
- eukaryotickou jadernou DNA lze izolovat z tkání, orgánů či bb. rostoucích v kultuře in vitro
- podstatou všech procedur je: rozpuštění komplexu DNA-protein a extrakce čisté nerozštěpené DNA bez příměsi RNA a bílkovin
Metoda fenolové extrakce
- nejpoužívanější
dá se použít pro extrakci DNA i RNA z nejrůznějších zdrojů
1) k dezintegraci nukleoproteinových komplexů se používají detergenty po šetrné homogenizaci bb. (opakované zmražení a rozmražení)
- nejčastějším detergentem je SDS (dodecylsulfát sodný)
- k detergentu se mohou přidávat ještě enzymy, které napomáhají odbourávání proteinů (proteinkináza K nebo pronáza)
- EDTA chelatuje Mg2+, které zprostředkují vzájemnou agregaci NK a agregaci NK s proteiny
2) oddělení denaturovaných proteinů od NK – centrifugace
- k dentaturaci se používá fenol nebo směs fenol-chloroform (1:1) za vyššího pH (8)
- chloroform rozpouští lipidy a usnadňuje denaturaci proteinů a vzhledem ke své hustotě zlepšuje oddělení organické fáze při centrifugaci od vodné fáze – obr.1)
- právě při pH = 8 přechází NK (DNA i RNA) do vodné fáze (obr. 1), zatímco provádí-li se extakce při pH = 5 - 6, pak ve vodné fázi zůstává jen RNA a DNA přechází do fáze organické. Vyšší pH při extrakci DNA je nutné i jako prevence depurinace.
- kvalita extrakce závisí na kvalitě fenolu (nesmí být oxidován)
3) před izolací čisté DNA je třeba ve vodné fázi odstranit pomocí RNAasy molekuly RNA
4) srážení (precipitace) DNA ledovým 95% ethanolem za přítomnosti solí (např. octan sodný octan amonný, NaCl), které usnadňují oddělení SDS od vzorku NK
5) precipitát DNA se vytáhne jako jedno vlákno namotané na skleněné kličce, opláchne 70% ethanolem a vysuší
- získaná DNA se může znovu rozpustit ve vhodném pufru (např. TRIS) s přidáním EDTA asi týden v chladničce při +4°C a dále skladovat při -70°C
Bezfenolová metoda
- ke srážení bílkovin se místo fenolu využívá koncentrovaný roztok soli (NaCl)
- po centrifugaci je NK v supernatantu, bílkoviny v sedimentu
- k precipitaci NK ze supernatantu se většinou užívá také ethanol
PCR
- metoda in vitro = tzv. řetězová polymerázová reakce PCR (polymerase chain reaction)
nevyžaduje žádný složitý aparát, pouze zvláštní DNA polymerázu a syntetické primery,
kterými se zahajuje replikace
pro zahájení PCR potřebujeme:
1. syntetický DNA primer
- krátké oligonukleotidové řetězce , které získáme automatickou syntézou
- odpovídá sekvencím na koncích DNA segmentu, který chceme zmnožit
2. DNA polymeráza, tzv. taq polymeráza
3. všechny (4) deoxyribonukleozidtrifosfáty (nukleotidy DNA)
Průběh reakce
1) každý cyklus začíná zahřátím směsi na 95oC → denaturace DNA na jednovláknové
molekuly
2) poté ochlazení na 50oC → navázání primeru (annealing) na komplementární sekvence DNA před a za místem, které chceme namnožit (musíme sekvence znát)
3) zvýšení teploty na 72oC → zahájení taq polymerace od navázaného primeru → vznikají
dvě kopie původní DNA
- po znovu zahřátí reakční směsi na 95oC se cyklus opakuje
- teplota 95oC nedenaturuje taq polymerázu, není ji třeba znovu dodávat a cykly se mohou
mnohokrát opakovat
- po 20-30 cyklech vytvoří milion až bilion kopií
- jeden cyklus trvá asi 5 minut
Další reakce
- produkt PCR se následně analyzuje nejčastěji po obarvení ethidium bromidem gelovou elektroforézou
- přítomnost určitého úseku DNA specifické délky v analyzovaném vzorku poznáme podle přítomnosti jednoho specifického proužku v gelu
- event. amplifikovanou DNA podrobíme štěpení určitým restrikčním enzymem (lze takto zjistit i bodové mutace v cílové DNA)
- protože primery při polymeraci jsou inkorporovány do amplifikovaného úseku, lze je na 5’ koncích určitým způsobem modifikovat. Např. pro metodu dot blotů nebo Southern blotů lze primery značit a použít jako hybridizační sondy, nebo se na 5’ konci primeru zavádějí bodové mutace, nebo se přidávají krátké sekvence (inserty) rozpoznávané restrikčními enzymy.
Invertovaná PCR - dají se namnožit i úseky s neznámou sekvencí - neznámý úsek sousedící s úsekem známým se zkrátí restrikční endonukleázou a konce molekuly se spojí do kruhu. Potom se přihybridizují primery ke známé sekvenci v takové orientaci, aby po rozštěpení této známé sekvence jinou restriktázou byl amplifikován právě neznámý úsek.
RT PCR (reverzní transkripce PCR)
- přepis RNA na DNA (resp. cDNA)
- použití termostabilní reverzní transkriptázy – umělého enzymu připraveného genovým inženýrstvým – který umožňuje reverzní transkripci RNA a namnožení vzniklé DNA
Uplatnění PCR
- velmi široké - základní význam v molekulární genetice
- obecně se metoda PCR používá všude tam, kde se používá klonování DNA - syntéza genů,
určování pořadí bazí, studium exprese, základ diagnostických souprav (virus HIV,
cytomegalovir, Herpes simplex,…) → diagnostické použití pro detekci infekčního původce
(agens) nemoci
- prenatální diagnostika
- kriminalistika - jednoznačná identifikace osob pomocí „genetických otisků prstů“
Žádné komentáře:
Okomentovat