Elektroforéza
- metoda umožňující separaci fragmentů DNA na gelu po zapojení do elektrického obvodu
- nukleové kyseliny se díky svému zápornému náboji pohybují k + pólům a svým pohybem tvoří pruhy, podle délky se pohybují různou rychlostí (čím méně bp, tím větší rychlost)
- používají se 2 typy gelů - agarózový a polyakrylamidový
- podle použitého napětí se dají eforézy dělit na nízko-, středně- a vysokonapěťové
Agarózový gel (AGE)
- nejčastější
- pro fragmenty 10 – 60 000 bp
- většinou horizontální uspořádání
- prášek se rozpustí ve speciálním pufru a směs se provaří v mikrovlnce
- vrstva gelu se převrství (1mm) pufrem (Tris – acetátový, Tris-borátový)
- hřebenem se v gelu vytvoří nanášecí jamky, do kterých se dává NK
- přidají se barvičky - ethidium bromid - naváže se na NK a ve spojení s ní po osvícení UV září
intenzivněji v místě, kde je NK
- gel je velmi nestabilní, kdysi se fotil, dnes používány kamery a PC
- na udržení NK v jamkách se používá tzv. nanášecí roztok (brání difundování naneseného vzorku z jamky do pufru)
- výsledek eforézy se prohlíží v procházejícím UV světle
- po skončení je nutno ethidium bromid speciálně likvidovat, ptže je to mutagen
- citlivost asi 1 – 5 ng DNA na proužek
Polyakrylamidový gel (PAGE)
- u tohoto gelu je rozdělení citlivější
- pro fragmenty 6 – 1 000 bp
- vzniká polymerací akrylamidu do lineárních řetězců, které jsou následně zesíťovány N,N´- methylen-bis-akrylamidem (BIS)
- vertikální gel - je několikrát silnější, větší
- ostatní prostředky eforézy (pufry, nanášecí roztoky, ethidium bromid) jsou podobné jako u agarózové eforézy
- citlivost asi 10 ng DNA na proužek
Blotting
= přenesení NK na hybridizační membránu (nitrocelulózová, nylonová)
- nejčastější způsob přenosu NK je kapilární atrakce, kdy se pufr nasává buničinou přes agarózový gel a hybridizační membránu. NK se uvolní z gelu a zachytává se v membráně (nekovalentní vazbou)
- účinný přenos NK se uskuteční již za 1 – 2 hodiny
- po přesátí se musí NK na membráně fixovat (pro nitrocelulózové filtry při teplotě 80 °C ve vakuu)
- poté se může provést hybridizace se značenu sondou
- southern blotting – DNA (podle zakladatele – Southern)
- nothern blotting - RNA
- western blotting - proteiny
- někdy se hybridizace neprovádí po předchozí elektroforéze, ale izolovaná NK se přímo nanese na hybridizační membránu v podobě skvrn (kulaté - tzv. dot bloty nebo čárky - slot bloty
Žádné komentáře:
Okomentovat