Buňky nasazené v určitém množství do kultivační láhve jsou nejprve kulaté, volně se pohy-bují v médiu a nemnoží se (tzv. období disperze), posléze začínají sedimentovat a adherovat k podložce (tzv. období uchycování). U stabilizovaných linií první buňky adherují již po 30 minu-tách, u primokultur toto uchycování trvá déle, asi 24 – 48 hodin. Jakmile se buňky přichytí k podložce, začínají se oplošťovat a rozprostírat (řádově do několika hodin) do tvaru charakteristického podle typu buněčné linie. Některé buňky inokula jsou méně vitálnější nebo byly poškozeny, takže se nepřichytí, naopak hynou. Z tohoto důvodu počátek růstové křivky obvykle vykazuje mírný pokles počtu buněk – tzv. lag fáze růstové křivky.
Po rozprostření začnou buňky intenzivně proliferovat, vstupují do logaritmické fáze růs-tu - tzv. log fáze růstové křivky. Znamená to, že logaritmus počtu buněk je lineární funkcí doby kul-tivace. Tato fáze nastává zhruba po 18 – 28 hodinách kultivace, u stabilizovaných linií i dříve.
Jakmile se vytvoří monolayer zaplněním podložky buňkami, končí log fáze a kultura přechá-zí do tzv. stacionární fáze růstu, kdy klesá růstová rychlost, buňky se přestávají množit, event. jich ubývá, pokud počet uhynulých buněk je vyšší než počet buněk vzniklých mitotickým dělením. Jednou z příčin zástavy množení buněk je u primokultur a diploidních linií kontaktní inhibice množení. Jinou příčinou je také vyčerpání živin, které vede k převaze katabolických reakcí a změně pH kultivačního prostředí.
Při vyčerpání živin může buněčná kultura přejít z log fáze do stacionární fáze, i když není ještě úplný monolayer buněk. Pokud se včas vymění médium, dojde k potencování log fáze, buň-ky pokračují v proliferaci a růstová křivka má pak dvoufázový charakter.
Každá buněčná linie je charakterizována třemi důležitými růstovými parametry:
• délka lag fáze – u stabilizovaných linií trvá přibližně 30 minut, u primokultur déle, asi 24 – 48 hodin. Pokud se použije tzv. předkultivované médium (nevyčerpané médium, ve kterém se již množily buňky) nebo při nízkém pH nemusí lag fáze nastat.
• maximální populační denzita – je to maximální počet buněk dosažený při stacionární kultivaci. Může být ovlivněna nevhodným pH prostředí, přítomností inhibitorů produkovaných buňkami, nedostatkem prostoru. Protože stabilizované linie často nemají kontaktní inhibici dělení a buňky se množí i po vytvoření monolayeru, dosahují tím vyšší denzity na jednotku plochy než u di-ploidních linií.
• generační doba – je čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci, respektive je to délka jednoho buněčného cyklu. Počítá se podle vzorce:
kde t = doba růstu, N0 = počáteční počet buněk, Nt = konečný počet buněk.
Generační doba je u heteroploidních linií relativně krátká (za optimálních podmínek se nejčastěji pohybuje kolem 20 hodin), u diploidních linií může být 24 hodin až několik dní. Délku generační doby ovlivňují růz-né vnější faktory (přívod živin v médiu, teplota, pH prostředí, druh a množství séra v kultivačním médiu), ale záleží také na typu buněčné linie.
Žádné komentáře:
Okomentovat