Buňky se kultivují při stálé teplotě (pro savčí buňky 37C, maximální rozmezí 35 – 38C), nejlépe v termostatu se stálou tenzí CO2. Obvykle se využívá atmosféry s 5% příměsí CO2, čímž se podporuje lepší funkce bikarbonátového pufru, který zajišťuje optimální pH kultivačního pro-středí na hodnotách 7,1 – 7,4 (maximální rozmezí pH 6,8 – 7,8). Pro snazší kontrolu pH se přidá-vá do média indikátor – fenolová červeň. V alkalickém prostředí má fialovou barvu, při optimál-ním pH je médium sytě červené. Čím je médium vyčerpanější a kyselejší, mění se barva na oran-žovou až světle žlutou.
Veškeré potřebné živiny se buňkám dodávají v kultivačním médiu. Je to izotonický roztok (buňky tolerují odchylky v rozmezí 10 % od této hodnoty) řady nízko a vysokomolekulárních látek. Jsou to hlavně ionty anorganických solí (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, PO43-, SO42-, HCO3-), glukóza jako zdroj energie, 13 aminokyselin (z 20 aminokyselin běžných v bílkovinách), 8 vita-mínů (např. kyselina listová, inositol, nikotinamid, kyselina pantotenová, pyridoxin, riboflavin), některé stopové prvky, hormony, ale i bílkoviny. Dnes se komerčně vyrábí více než 20 druhů růz-ných médií – jednodušších (Hanks, Earle) i složitějších (Eagle, RPMI) pro kultivaci buněk nejen savců, ale i hmyzu a rostlin.
Doposud nezbytnou součástí přesně definovaných médií pro aktivní růst buněk je určitý podíl (5 – 10 %) krevního séra. Slouží především jako zdroj různých růstových a adhezivních faktorů, které usnadňují přichycení buněk k podkladu ve stacionární kultuře. Bílkoviny séra mimo jiné mají i funkci detoxikační a zároveň zvyšují viskozitu kultivačního média. Nejvhodnější séra jsou z mladých zvířat, krmených tradičním způsobem – telecí a bovinní sérum, pro náročnější kultivace se užívá i fetální telecí sérum. Jen málo buněčných linií nevyžaduje přítomnost séra (obvykle se jedná o transformované buňky, které mohou růst i v suspenzní kultuře).
Práce s buňkami pěstovanými in vitro vyžaduje dodržování přísné sterility. Do média se běžně přidávají antibiotika (PNC, STM), ale i ostatní ingredience a veškeré materiály musí být sterilní (užívá se horkovzdušná sterilizace, autoklávování, filtrace přes speciální filtry). Vlastní práce s kulturami se provádí v tzv. laminárních boxech, které lze fyzikálně sterilizovat (UV záření, filtrování vzduchu apod.). Všechny použité chemikálie včetně vody musí být nejvyšší čistoty; materiály musí reagovat neutrálně a musí být v kultivačním prostředí inertní – speciální silikonová pryž, nerezová ocel, speciální „tkáňové“ sklo. Výrobky z těchto materiálů musí před použitím pro-jít speciálním mycím postupem – mechanické odstranění nečistot, chemická úprava povrchu, dokonalé odstranění použitých mycích prostředků, sušení, balení do nehořlavého papíru a sterili-zace. Vzhledem k časové náročnosti tohoto postupu se dnes stále více užívají výrobky z plastic-kých materiálů pro jedno použití.
Žádné komentáře:
Okomentovat