Loading

19.2 Terminologie

Tkáňovou nebo orgánovou kulturou se rozumí udržování nebo více než 24hodinový růst určité tkáně nebo části orgánu in vitro v podmínkách, které věrně napodobují fyziologickou situaci, tj. v pufrovaném roztoku s živinami. Jsou zakládány z fragmentů tkání a jsou vhodným objektem zejména pro studium specifických tkáňových či orgánových funkcí. V orgánových kulturách nejsou buňky odděleny, a proto mohou stále navzájem na sebe působit, tak jako v neporušeném organismu. Jelikož kompaktní struktura orgánových kultur zabraňuje přístupu živin a kyslíku ke všem buňkám, mají tyto kultury pouze omezenou dobu života. Potřeba opětovného zakládání orgánových kultur předpokládá neustálé dodávání nových tkání, odvozených buď ze zvířat nebo z člověka. Orgánové kultury jsou používány např. v testování účinku teratogenů a v testování kožní dráždivosti. Termín „tkáňová kultura“ je historicky starší a někdy se používá nepřesně i k označení buněčných kultur, event. jako obecný pojem pro všechny metody pěstování buněk v podmínkách in vitro.
Buněčnou kulturou se rozumí udržování nebo růst jednotlivých eukaryontních buněk in vitro. Buněčné kultury jsou zakládány především z buněčných suspenzí, které se získají enzymatickým uvolněním buněk z odebrané tkáně. Z používaných enzymů jsou to hlavně kolagenáza, pronáza nebo trypsin, často v kombinaci s EDTA, která váže a odstraňuje Ca2+ z media a také ruší vazby mezi buň-kami i vazby buněk k extracelulární matrix. Dnes už méně často se suspenze připravují mechanicky, rozřezáním tkáně či jejím protlačením přes jemná síta. Často se k přípravě buněčných kultur používají jako výchozí materiál embryonální tkáně, neboť mezibuněčné spoje nejsou ještě tak pevné a suspenzi lze získat snáze. Za posledních 20 let byli vědci schopni úspěšně kultivovat široké spektrum typů buněk. Každý typ buněk, ať už jaterních, ledvinových, srdečních, mozkových či kožních, však má své vlastní požadavky, jež musí být sktriktně dodržovány.

19.2.1 Stacionární a suspenzní kultury
Buněčné kultury se klasifikují podle několika kritérií. Jedním z nich je způsob kultivace buněk. Ve stacionárních kulturách se buňky pěstují na pevné podložce - sklo, umělá hmota (speciálně upravený polystyren pro tkáňové účely). Někdy se musí povrch pevné podložky ještě speciálně upra-vovat např. vrstvou kolagenu, fibrinu aj.
Množství získaných buněk je omezeno celou řadou faktorů, které souvisejí s metabolismem pěstovaných buněk. Tyto faktory zpravidla vedou k negativním změnám v tekuté i plynné fázi kulti-vačního prostředí. Za optimálních podmínek (odstraňování toxických zplodin metabolismu pravidel-nou výměnou kultivačního média, stabilní tenze CO2) buňky vytvoří již během 2 – 3 dní souvislý jednovrstevný porost – tzv. monolayer. Použijí-li se různě upravené podložky (plastová mřížka, celu-lózová houba), lze dosáhnout prostorového růstu buněk, takže taková kultura se více blíží poměrům ve skutečné tkáni.
Druhým typem kultivace jsou tzv. suspenzní kultury, kdy buňky rostou volně v médiu, tj. v suspenzi ve speciálně konstruovaných kultivačních tancích, v nichž se médium vyměňuje buď peri-odicky, nebo kontinuálně. Stejně tak se odebírají i namnožené buňky. Předností suspenzní kultivace je získání gramových množství buněk. Tento způsob kultivace je však použitelný pouze pro buňky s tzv. nelimitovaným růstovým potenciálem (hlavně nádorové buňky), které jsou schopné se množit bez kontaktu s pevnou podložkou.

19.2.2 Primokultura
Jedná se o buňky, které jsou poprvé pěstovány mimo organismus in vitro. Primokultura se za-kládá z buněčné suspenze, která se získala rozvolněním odebrané tkáně. Získaná suspenze obsahuje směs různých buněčných typů. K získání buněk pouze určitého typu pro potřeby další kultivace se mohou použít např. protilátky specificky rozpoznávající požadovaný buněčný typ. Tyto buňky se pak mohou imobilizovat vazbou protilátek na nějaký pomocný povrch, zatímco nežádoucí buňky se opa-kovaným promytím z tohoto povrchu odstraní.
V průběhu přípravy buněčné suspenze pro primokulturu mohou být buňky poškozeny enzyma-tickým nebo mechanickým rozvolněním z tkáně, takže podíl mrtvých buněk v suspenzi je vysoký (ži-vých buněk je podle použité metody 1 – 30 %). Buňky v primokultuře se zpočátku množí velmi pomalu, ale dříve nebo později (za 1 – 2 týdny) dorostou do souvislého monolayeru.
Pokud buňky vytvoří souvislý monolayer, přestávají se vlivem kontaktní inhibice růstu množit. Aby se mohly množit dále, musí se přesadit – pasážovat – do nové kultivační nádoby. Ze dna kulti-vační nádoby se buňky uvolňují nejčastěji krátkodobým působením trypsinu nebo jiných látek (např. chelaton), eventuálně se mohou mechanicky seškrábnout speciální stěrkou.
Primokultury lze založit nejen z živočišných buněk, ale také z buněk vyšších rostlin. V tomto případě je však nutné buňky nejprve zbavit jejich buněčné stěny; získané protoplasty se kultivují v chemicky definovaných médiích.

19.2.3 Diploidní buněčná linie
Pokud nasadíme suspenzi buněk získanou z primokultury do nové kultivační nádoby, založíme tak buněčnou linii, kterou lze pěstovat sice dlouhodobě, přesto její trvání je časově limitováno. Je to tzv. diploidní buněčná linie. Buňky zpočátku morfologicky a často i funkčně (včetně enzymatické výbavy) odpovídají buňkám původní tkáně, také počet chromozomů zůstává diploidní (více než 95 % buněk má chromozomovou skladbu odpovídající karyotypu buněk původní tkáně) a většinou si buňky uchovávají i kontaktní inhibici dělení a pohybu. Také jsou negativní testy malignity (buňky nevyvo-lávají po aplikaci do zvířete vznik nádoru).
Buňky diploidní buněčné linie se zpočátku rychle množí, k vytvoření monolayeru dochází bě-hem 2 – 3 dní. Postupně však rychlost proliferace buněk klesá až nakonec linie zanikne. Počet pasáží diploidní buněčné linie se liší podle druhu živočicha – myší a křeččí linie rostou asi 10 – 25 pasáží, lidské novorozenecké buňky kolem 40 – 60 pasáží, tj. asi 60 – 80 buněčných cyklů každé buňky. Do jisté míry to závisí na stáří organismu, ze kterého tkáň pro kultivaci byla odebrána. Čím bude jedinec v okamžiku odebrání tkáně starší, tím obvykle se dosáhne menšího počtu pasáží diploidní buněčné linie – tomuto jevu se říká Hayflickův limit. Kolik buněčných cyklů může absolvovat buňka souvisí pravděpodobně s délkou telomer na koncích chromozomů. Protože schopnost množit se je u buněk diploidní buněčné linie limitována, označují se někdy jako buňky s limitovaným růstovým potenciá-lem. Buněčné kultury rostlinných buněk obvykle mají také limitované trvání, neboť doposud nebyla pozorována transformace rostlinných protoplastů v „nesmrtelné“ buňky.

19.2.4 Stabilizovaná buněčná linie
Někdy buněčná linie neuhyne; mohou se v ní vyskytnout transformované buňky se změněnými vlastnostmi, které se stanou základem stabilizované (heteroploidní, heteronukleární) buněčné linie. Tato linie se vyznačuje ztrátou orgánové specifity a vysokým podílem aneuploidních buněk s odchylným nejen počtem, ale i morfologií chromozomů. Numerická změna není ve všech buňkách stejná, proto se často používá označení „heteroploidní linie“. Tyto buňky zpravidla ztrácejí též kon-taktní inhibici pohybu i množení, snáze mohou růst v suspenzi, eventuálně ve stacionární kultuře mo-hou růst ve více vrstvách. Mívají též nižší nároky na přítomnost růstových faktorů v kultivačním mé-diu. Často vykazují pozitivní testy malignity. Transformované buňky mají neomezený růstový poten-ciál, stávají se „nesmrtelnými“, což znamená, že je lze prakticky neomezeně dlouho, i řadu let, pěsto-vat in vitro.
Ztráta orgánové specifity není projevem dediferenciace, jak se původně předpokládalo, ale vý-sledkem selekčního tlaku na buňky pěstované in vitro. K prvé selekci dochází již při mechanickém či enzymatickém rozvolnění buněk z tkáňových fragmentů. V založené primokultuře tedy může pře-vládnout vitálnější buněčný typ, který je jinak v organismu pod negativní kontrolou. Dalšími selekč-ními činiteli při pěstování buněk in vitro mohou být druh použitého média (může selektivně stimulo-vat růst jen některých buněčných typů) a také poměr objemu kultivovaných buněk k objemu kultivač-ního média. V kultuře na rozdíl od organismu je podíl extracelulárních tekutin vyšší. To může vést ke ztrátám některých látek produkovaných buňkami do okolního prostředí a jejich chybění či nedostatek pak mohou měnit směr některých důležitých metabolických pochodů.
Buněčných populací s neomezeným růstovým potenciálem je dnes udržováno ve světových tkáňových bankách několik set. Každá linie je vybavena popisem základních charakteristik i spektrem použití. Jednou z prvních stabilizovaných buněčných linií, která se užívá již přes 50 let, je myší bu-něčná linie L (Earle, 1943). Jedná se o buňky fibroblastoidního typu odvozené z pojivové tkáně. Přes 40 let se užívá lidská buněčná linie epiteloidního typu HeLa (Gey a spol., 1952), odvozená z karcinomu děložního čípku, a HEp-2 (Moor, 1955), odvozená z epidermoidního karcinomu hrtanu. Z dalších stabilizovaných buněčných linií používáme např. melanomovou linii Bowes, linii HT-29 (odvozenou z lidského epiteloidního kolorektálního adenokarcinomu) nebo linii Jun-1 (odvozenou z fibrosarkomu transgenní myši H2K-v).

Žádné komentáře:

Okomentovat