23. Využití bb. kultur pro stanovení toxicity, příklady testů

Testování na bb. kultůrách je tu od toho, aby nahradilo testování na lidech či spíše zvířatech, což bylo v minulosti celkem populární (např.: stanovení letální dávky LD50). To se moc nelíbilo... dnes testy na zvířatech regulovány organizacemi FRAME, ZEBET... čili testování toxicity na bb. kulturách je taková alternativa, která se snaží přiblížit kvalitám testování na živých tvorech. Dnes je to důležité především pro testování léčiv a cokoli, co má jít do lidského těla.
Taková látka by měla projít:
- testy na toxicitu – mutagenicitu (karcinogenitu) – testy na nežádoucí imunitní reakce

Testy na cytotoxicitu
Dělí se do skupin, podle toho, co testovaná látka v b. Ovlivňuje:
viabilita
test založen na porušení membránové integrity. Rozlišení živá/mrtvá
- neutrální červeň – v živé b. se hromadí v lyzosomech
- diacetyl fluorescein – vychytáván živou b. a rozkládán na fluoreskující fluorescein (zelený)
- trypanová modř – pronikne do mrtvé b.
- ethidium bromid, propidium jodid – barvení neviabilních bb. - červená fluorescence
- + filtrační test a agardifúzní test (viz. níže)

proliferace
Účinek látek na bb. proliferaci – určování nárůstu bb.:
- Přímé pozorování - (časosběrná videomikroskopie)
- celkový buněčný protein – briliantová modř, Coomasie modř
- DNA – inkorporace radioaktivně značených oligonukleotidů
- ATP – identifikace podle síly luminiscence
- dnes se zjišťuje poměr ATP/ADP – konst. u viabilních bb.

metabolická aktivita
Alternativa k testům viability (permeability membrán)
- tetrazoliové soli jsou redukovány extramitochodriálními dehydrogenázami a vznikají rozpustné ve vodě nebo nerozpustné ve vodě formazany
- 96 jamkových destiček

DNA čipy a microarrays
Vzestup, nebo pokles genové exprese – DNA,RNA, proteiny
-viz ot. DNA čipy a microarrays

TESTY:
- agar difuzní test
- neutrální červeň – (pinocytźa) živé buňky jsou obarveny červeně , neviabilní ztrácí zbarvení, protože NČ difunduje z lyzosomů do relativně velké agarové zóny
- thiazolová modř – viabilní buňky dehydrogenázami přeměňují thiazolovou modř na modré ve vodě nerozpustné formazány; neviabilní bb. zůstanou žluté
- následuje mikroskopické hodnocení, archivace – fotky Petriho misek

ultrafiltry (Millipore)
- průkaz sukcinát dehydrogenázové aktivity (SDH)
- viabilní bb. se barví modrofialově a buňky neviabilní se nebarví
- není možno hodnotit mikroskopicky (filtr není transparentní)
- průkaz přeměny diacetyl fluoresceinu na fluorescein (FDH)
- mrtvé buňky se nezbarví
- barví se živé bb. - jsou schopny uskutečnit tuto reakci
- gró metody spočívá v nepropustnosti membrány pro produkt – fluorescein
- buňky budou fluoreskovat zeleně

- mikrotitrační destičky
- stanovení metabolické aktivity
- 96 jamek
- průkaz dehydrogenázové aktivity
- tetrazoliová sůl je dehydrogenázami přeměněna na ve vodě rozpustné oranžové formazány
- fotometrické zhodnocení – aktivní bb. jsou zbarveny
- též možnost nepřímého kolorimetrického měření celkových proteinů – Brilliant Blue

testy mutagenicity:

Amesův test
SCE (výměna sesterských chromatid)
Transgenní myš Big Blue