Protože voda při zmrznutí zvětšuje svůj objem, dochází k roztrhání především buněčných membránových struktur (led prorůstá mezimolekulárními póry v buněčné membráně). Dalším negativním faktorem, který může při zmrazování usmrcovat buňky, je vzestup osmolality buňky. Při zmrazování je voda vázána do ledových krystalů a dochází tak k dehydrataci jak membránových systémů, tak i ostatních buněčných struktur. Často se současně mění i pH buňky, zrychlují se biochemické reakce, neboť stoupá koncentrace různých substrátů a enzymů. Těmto pochodům při procesu zmrazování buněk se říká efekt roztoku (solution effect). Při zmrazování buněčných suspenzí se může uplatnit i tzv. cell packing effect – ve zmrzlém stavu jsou buňky nahloučené těsně u sebe a mohou je poškodit i extracelulární ledové krystaly.
K zmrazování jsou citlivější buňky obsahující velké množství vody (např. živočišné buňky). Při pomalém zmrazování se uplatní hlavně efekt krystalizace vody, při rychlém zmrazování spíše efekt roztoku. Negativní vliv vody a ledu se proto omezuje použitím kryoprotektiv.
Intracelulární kryoprotektiva (např. glycerol, DMSO) používající se ve vysokých osmolárních koncentracích pronikají do buňky a nahrazují nitrobuněčnou vodu. Snižují bod tuhnutí a zvětšují podíl nezmrzlé kapaliny i při teplotách pod bodem tuhnutí. Tím zabraňují nadměrné dehydrataci buněk – kryoprotektivum ředí přítomné soli, pro buňka neztrácí vlivem osmózy tolik vody.
Extracelulární kryoprotektiva (např. dextran, polyvinylpyrolidin, hydroxyethyl škrob) aplikovaná v nízké osmolární koncentraci do buňky nepronikají. Bod tuhnutí snižují málo, proto se obvykle nepoužívají samostatně. Jejich účinek spočívá hlavně v zábraně tvorby nukleačních center a znemožnění růstu krystalů ledu.
Jedním ze způsobů kryotrotekce je také hluboké zmrazení buněk v tekutém dusíku nebo héliu na -150 až -180°C, kdy dochází k tzv. vitrifikaci vody. Dochází k tvorbě amorfního ledu, jehož krystalky jsou tak malé, že buňku nepoškozují.
Při zmrazování buněk se tedy postupuje přibližně rychlostí 1 °C za minutu – připraví se vychlazené DMSO v séru a vychlazené zamražovací zkumavky (4 °C), buňky se převedou do suspenze, centrifugují se 5 minut při 4 °C a 500 otáčkách za minutu. Po odsátí supernatantu se přidá vychlazené DMSO a buňky se rozpipetují do zamražovacích zkumavek. Potom se na 30 minut uloží do 20 °C, dále na 60 minut do –80 °C a nakonec do tekutého dusíku. Zmrazené buňky lze uchovávat dlouhodobě – nejlépe pod tekutým dusíkem (roky až desítky let) nebo v plynné fázi dusíku (roky) při teplotách -150°C. Problém kryokonzervace celých orgánů a organismů není stále vyřešen. V současné době lze ze savčích buněk zmrazovat pouze buněčné suspenze nebo tkáně plochého tvaru (např. kůže), ale je nutné použití kryoprotektiv. U prokaryontních organismů a u kvasinek se může k dlouhodobému konzervování buněk použít lyofilizace, což je mrazová sublimace. Voda se odpařuje - ze zmrazeného vzorku pod vakuem a namrazuje se na kondenzační spirálu chlazenou na -50 °C. Lyofilizované kultury bakterií lze uchovávat dlouhodobě při pokojové teplotě a po opětném rozsuspendování ve vodě jsou životaschopné. Nevýhodou však je, že lyofilizací nelze konzervovat všechny druhy eukaryontních buněk, pouze kvasinky.
Při rozmrazování buněk se musí postupovat poměrně rychle (zkumavky vyjmuté z tekutého dusíku se nechají asi 1 minutu při pokojové teplotě, potom se asi 2 – 3 minuty protřepávají na vodní lázni při 37 °C a hned po rozmražení se převedou do kultivačního média, aby se rozředilo přítomné kryoprotektivum - DMSO). I tak určitý podíl buněk uhyne (např. viabilita kmenových buněk kostní dřeně po rozmrazení z tekutého dusíku nebo mrazicího boxu je asi 80 %). Nejčastěji při rozmrazování jsou buňky poškozeny rychlým vstupem vody do buňky, která ještě obsahuje vysokou nitrobuněčnou koncentraci glycerolu. Důsledkem změněných osmotických poměrů buňka lyzuje.
Výpisky:
↓ºC → ↓metabolických pochodů, exprese heat shock proteins HSP
kryoprezervace – tvorba krystalků ledu
pomalé zmrazování - krystalizační centra vně buněk, velké krystaly, voda jde ven z buňky
rychlé zmrazování - množství malých krystalků ledu uvnitř b., může poškodit membrány
hexagonální led – nestabilní, rekrystalizace
živočišné bb. citlivější – hodně vody
Při pomalém zmrazování se uplatní hlavně efekt roztoku, při rychlém zmrazování spíše efekt krystalizace vody.!!!!!!!!
efekt roztoku (solution effect)
• voda při zmrznutí zvětšuje svůj objem
• vzestup osmolality buňky - dehydratace
• pH buňky
cell packing effect
Intracelulární kryoprotektiva - glycerol, DMSO
Extracelulární kryoprotektiva - dextran, polyvinylpyrolidin, hydroxyethyl škrob
zmrazení b.v tekutém dusíku nebo héliu ( -150 až -180C)- vitrifikace vody
lyofilizace
ZMRAZOVÁNÍ
- použití pro buněčné kultury a ploché tkáně
- vychlazené zmrazovací zkumavky na 4°C
- intracelulární kryoprotektivum DMSO v séru
- tvorba suspenze
- centrifugace
- odsátí supernantantu
- rozpipetování do zmražovacích zkumavek
- 20 minut do -30
- 60 minut do -80
- tekutý dusík (-150)
LYOFILIZACE
- prokaryontní bb. a kvasinky
- zmrazený vzorek
- vakuum
- odpařování vody a namražování na kondenzační spirálu
- uchovávání při pokojové teplotě
- po rozsuspendování ve vodě opět viabilní
ROZMRAZOVÁNÍ
- 1 minuta při pokojové teplotě
- 2-3 minuty ve vodní lázni – 37°C
- vložení do kultivačního media - zředění DMSO a glc
- viabilita okolo 80 %
Medicínská aplikace snížené teploty:
Lokální hypotermie – sportovní medicína
Lokální hypotermie – kryochirurgie
Extra-korporeální hypotermie – chirurgie na otevřeném srdci
- možnost zmrazit si svoje kmenové bb. z pupečníkové krve. Existuje něco, jako - “bankovní systém kmenových buněk“ (stem cells banking). Poté lze použít třeba místo transplantace kostní dřeně.
Jinou konzervaci živočišných bb., než zmražování a lyofilizaci, jsem nenašel... ovšem uchování nabízí plno krémů od farmaceutických
Žádné komentáře:
Okomentovat