Loading

74. Moderní cytogenetické vyšetřovací metody (FISH, spektrální karyotypování, komparativní genomová hybridizace atd.)

Cytogenetika:
Lidské buňky je možné kultivovat in vitro stejně jako jakékoliv jiné savčí buňky.
Cytogenetika se rozvíjela na konci 50. let – chromosomy, proužkování, karyotyp atd. V součastné době se přechází na DNA diagnostiku.

ISH (hybridizace in situ)
Je-li k dispozici specifická sonda pro daný gen, je možné provést hybridizaci in situ, tj. přímo v preparátu dělících se buněk na jejich chromozomech. Cytologickými metodami (nejčastěji G-pruhováním) se identifikuje každý chromozom. Hybridizace se provádí přímo na sklíčku se zafixovanými buňkami po inkubaci s RNAsou a hydroxidem sodným (je třeba degradovat RNA a DNA denaturovat v alkalickém prostředí). Přidaná radioaktivně značená sonda se váže na komplementární sekvence v denaturované struktuře chromozomu. Po promytí, přiložení autoradiografického filmu, po jeho expozici a vyvolání se objeví v místě vazby sondy na chromozom specifická skvrna. Ta ukazuje, na kterém chromozomu a přibližně v jakém místě je daný gen lokalizován. Metoda není příliš citlivá, ale pro svou jednoduchost se stále často používá, i když je časově náročná.

FISH (fluorescenční hybridizace in situ)
- velmi citlivá molekulárně-cytogenetická metoda
- umožňuje hodnotit karyotyp a detekovat numerické a strukturní chromosomové odchylky v buňkách v mitose i v nedělících interfásních jádrech
- doplňuje a upřesňuje výsledky získané konvenční cytogenetickou analýzou
- je to modifikace ISH
- zavedena v r. 1988 (sondy značené fluorochromy)

základní postup metody:
– denaturace sondy i cílové DNA
– hybridizace sondy a cílové DNA
– odstranění nespecifických signálů (působení formamidu či roztoku o nízké iontové síle při vyšší teplotě odstraní sondu z ne úplně komplementárních míst)
•koncentrace sondy je výrazně vyšší než cílové DNA (uměle se zvyšuje dextransulfátem (polymer váže vodu))
•sonda značena:
– přímo (fluorochromem) - používají se dnes častěji
– nepřímo (haptenem, který se detekuje značenou protilátkou)

Pomocí různých fluorochromů lze získat různobarevný fluorescenční signál navázaných sond na chromozom. Nejprve je třeba získat potřebnou sondu a tu označit vhodným fluorescenčním barvivem (zelený fluorescein, červená texaská červeň, rhodamin atd.).

Na detekci jednotlivých typů chromozomových aberací se užívají 3 typy hibridizačních sond:

a) sondy pro specifické chromozomové struktury (satelitní sondy hybridizující se sekvencemi přítomnými hlavně v centromerách nebo telomerické sondy hybridizující se sekvencemi telomer)
b) sondy pro specifické jedinečné sekvence DNA (např. sekvence, ve kterých jsou mutace podmiňující příslušné klinické syndromy, nebo charakteristické pro získané přestavby chromozomů jako je filadelfský chromozom)
c) celochromozomové sondy (malovací), které se skládají ze směsi sekvencí z různých částí celého chromozomu, takže mohou označit celý chromozom

Místo lokalizace značené sondy lze zjistit mikroskopicky v preparátu chromozomů, proto se mluví o „hybridizaci in situ“. Prostorově lze od sebe odlišit dvě sondy vzdálené jen 1000 párů bazí, zejména použije-li se současně více různých fluorochromů pro odlišení jednotlivých sond.
Tuto metodu lze použít i k vyšetření interfázických buněk nebo tkáňových řezů zalitých do parafínu.
Prakticky se metoda používá k:
- určování početních a strukturálních chromozomových aberací (částečných trizomií a monozomií)
- chromozomová konstituce interfázických buněk
- rychlá prenatální diagnostika (nekultivované amniocyty)
- preimplantační diagnostika (při asistované reprodukci)
- vyšetření frekvence aneuploidií u spermií (neplodnost)
- chromozomální vyšetření solidních tumorů (po chirurgické excisi)
- určení původu vrozených a získaných marker-chromozomů
- jednotlivé buněčné klony v mozaikách
- srovnání genomů jednotlivých rostlinných a živočišných druhů
- určení chromozomového vybavení jader v interfázi
- studiu polohy jednotlivých chromozomů v jádře nebo jednotlivých genů v jádře v interfázi či v mitóze
- mapování chromozomů
- detekci virových a bakteriálních genů v tkáňových řezech
- detekci a diagnostice maligních procesů (včetně detekce minimální residuální choroby nebo časného relapsu u leukémií)
- diagnostika mikrodelečních syndromů a složitých těžko určitelných translokací – submikroskopické chromozomové aberace
- sledování úspěšnosti transplantace kostní dřeně

KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE (CGH)
Novější varianta metody FISH, která detekuje relativní počet kopií jednotlivých sekvencí mezi dvěma různými genomy. Zpracování DNA z jakékoli tkáně je možné bez kultivace. Celková DNA jednoho vzorku se označí červenou fluoresceční barvou, DNA druhého vzorku zelenou barvou. Oba vzorky se smísí ve stejných množstvích a použijí se jako malovací sonda v metodě FISH s normálními metafázickými chromozomy. Potom se změří poměr červené a zelené fluorescence emitované sondou navázanou podél celého chromozomu. Je-li DNA konkrétní oblasti chromozomu zastoupena rovnoměrně u obou vzorků, je poměr signálu 1:1. Jestliže vzorek označený červeně obsahuje abnormální množství genetického materiálu (monozomie, trizomie), posouvá se poměr červené a zelené fluorescence buď k hodnotám nižším než jedna u monozomie, nebo k hodnotám vyšším než jedna u trizomie, a to v těch oblastech chromozomu, kde je abnormální dávka genů. Metoda je nejvíce používána při analýze chromozomálních aberací v nádorových buňkách solidních nádorů. Neumí však odhalit přestavby chromozomů, které nejsou spojeny se změnami v množství DNA.


SPEKTRÁLNÍ KARYOTYPOVÁNÍ (SKY) a MNOHOBAREVNÁ FISH (mFISH)
Nezbytný požadavek metod je soubor 24 různých chromozomových malovacích sond pro 22 lidských autozomů a pohlavní chromozomy X a Y. Každá sonda je označena odlišnou kombinací fluorescenčních barev. V současnosti se většinou vystačí s kombinací 5 různých fluorochromů, základní barvení chromozomů na preparátů se provádí pomocí DAPI. Hodnocení mitóz se provádí pomocí vysoce citlivé CCD kamery dvěma různými způsoby.
U SKY metody je nakonec vypočítáno spektrum emisního světla a následně všem pixelům obrazu s identickým spektrem je přiřazena specifická barva. Ke snímání signálů fluorochromů se užívá spektrometru.
U metody mFISH se obraz postupně snímá přes 6 různých optických filtrů s úzkým spektrem. Pomocí počítačového programu je mnohobarevný obraz analyzován po jednotlivých pixelech a pro každý bod je nalezen nejlépe barevně odpovídající chromozom. Tato metoda umožňuje snadno pozorovat strukturální přestavby a identifikovat zúčastněné chromozomy. Zejména se využívá pro klasifikaci přestaveb v nádorových buňkách.

Multicolor FISH (M-FISH)
•2. pol. 90. let 20. stol. - modifikace metody FISH
•nutná kultivace buněk pro získání kvalit. mitóz

Výhody molekulárně-cytogenetických metod:
- Umožňují hodnocení i velmi nekvalitních mitos, které jsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodné.
- Poskytují informace i z nedělících se nebo terminálně diferencovaných buněk
Výrazně zkracují nutnou dobu k získání a interpretaci výsledků

Molekulárně-cytogenetické metody (souhrn):
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Mnohobarevná FISH (mFISH)
Spektrální karyotypování (SKY)
Mnohobarevné pruhování s vysokou rozlišovací schopností (mBAND)
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
– Matrix Matrix CGH
PRINS
Rx FISH
M-TEL
Halo preparace
MikroFish

Žádné komentáře:

Okomentovat